文献类型： 中文期刊

第一作者： 曲士松

作者： 曲士松;刘宪华;黄宝勇;王淑芬;徐培文

作者机构：

关键词： DNA提取;大蒜;白菜;CTAB

期刊名称： 山东农业大学学报(自然科学版)

ISSN： 1000-2324

年卷期： 2000 年 31 卷 04 期

页码： 427-429

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 在分子生物学研究中 ,提取ＤＮＡ对于试验成功极其重要。由于植物材料好处理 ,其ＤＮＡ更难提取。而且种类繁多的植物所含化合物 (如多糖、脂肪、单宁类物质、酚类及色素物质 )不同 ,因而对于一种植物材料适用的ＤＮＡ提取方法应用于其它植物材料不一定成功。有的植物ＤＮＡ提取方法由于产量低 ,需要大量的样品组织 ;这对于需要从许多少量样品个体中提取ＤＮＡ的研究不适用。ＣｓＣｌ梯度离心的方法既费时又昂贵。近年来已经建立了许多简便、经济的方法 ,使用这些方法能从少量样品组织中提取高产量的ＤＮＡ ,ＣＴＡＢ法是其中之一。该法使用ＣＴＡＢ(十六烷基三甲基溴化胺 )作为ＤＮＡ提取剂〔2 ,3〕。大蒜、白菜、萝卜等组织细胞中富含粘液 (其成分主要为多糖 ) ,ＤＮＡ不易提取。我们在Ｊ Ｄｏｙｌｅ和Ｌ Ｄｏｙｌｅ建立的ＣＴＡＢ法基础上摸索了大蒜、白菜ＤＮＡ提取的条件 ,并作了适当改进〔1〕,测定了该法提取的大蒜、白菜ＤＮＡ的产量和质量 ,并以其为模板进行了ＲＡＰＤ操作。1　材料与方法1 1　材料国内及国外 60多个大蒜品种中 ,2 4个白菜品种和 7个萝卜品系。1 2　ＤＮＡ提取过程中所用溶液及试剂2×ＣＴＡＢ缓冲液 :　　 1 0 0ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-Ｃｌ(ｐＨ 8 0 )2 0ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ (ｐＨ 8 0 )1 4ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ2 %ＣＴＡＢ氯仿 /异戊醇 (2 4∶1 )异丙醇75%乙醇1 0ｍｇ/ｍｌＲｎａｓｅＴＥ缓冲液 (ｐＨ 8 0 )1 3　ＤＮＡ提取步骤1 )用蒸馏水把样品材料冲洗干净 ,用吸水纸吸去材料表面的水分。称取幼嫩叶片 (或其它组织 )约 0 1～ 0 3ｇ ,置于研钵或塑料袋中 ,加2ｍｌＣＴＡＢ提取液 ,充分研磨。2 )取 1 0ｍｌ到 1 5ｍｌ离心管中 ,65℃水浴中置 30ｍｉｎ。3)加入氯仿 /戊醇至满 ,混匀。4) 1 50 0 0ｒ/ｍｉｎ简单离心 ,转移上清到一个新管中 ,并加入 60 0 μｌ异丙醇。5)小心颠倒离心管数次 ,稍离心 ,去掉上清 ,加入 80 0 μｌ 75%乙醇清洗沉淀。6)离心 ,倒掉上清 ,再次清洗。7)室温下吹干ＤＮＡ ,加入 1 0 0 μｌＴＥ缓冲液和 2 μｌＲｎａｓｅ。8)置于 - 2 0℃贮存。1 4　ＤＮＡ的浓度和质量的检测琼脂糖凝胶电泳法 :取 1 μｌ提取的ＤＮＡ ,加入 9μｌＴＥ染料 ,1 0 %浓度的琼脂糖凝胶电泳 ,溴化乙锭染色后 ,紫外分析仪上观察。紫外分光光度计法 :用蒸馏水将提取的ＤＮＡ稀释 1 0 0 0倍 ,在ＢｅｒｋｍａｎＤＵ640紫外分光光度计上测量 2 60ｎｍ和 2 80ｎｍ处的ＯＤ值。1 5　ＤＮＡ浓度与纯度用这种方法提取大蒜ＤＮＡ ,浓度通常在50 0ｎｇ/μｌ左右 ,提取白菜、萝卜ＤＮＡ ,浓度在2 0 0ｎｇ/μｌ左右 (表 1 ,表 2 )。表 1　大蒜ＤＮＡ浓度 (ｎｇ/ μｌ )Ｔａｂｌｅ 1ＧａｒｌｉｃＤＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (ｎｇ/ μｌ)ＤＮＡ编号浓度(ｎｇ/ μｌ)ＤＮＡ编号浓度(ｎｇ/ μｌ)ＤＮＡ编号浓度(ｎｇ/ μｌ)ＤＮＡ编号浓度(ｎｇ/ μｌ)16 0 16 5 0 3115 0 46 2 5 02 5 0 0 1740 32 12 5 472 5 03 2 5 0 1810 0 33 5 0 0 4812 546 0 192 0 345 0 4912 55微量 2 0— 35 5 0 5 0 306微量 2 12 40 36 10 0 5 13576 0 2 2 2 5 0 3712 5 5 2 3586 0 2 3 2 40 386 5 5 3—96 0 2 4— 396 5 5 42 510 6 0 2 5 2 0 0 40 12 5 5 5 6 511— 2 6 2 0 0 416 5 5 6 10 012 80 2 715 0 42 12 5 5 76 513 10 0 2 815 0 43 12 5 5 810 014— 2 95 0 0 4412 5 5 912 515 6 0 30 5 0 0 45— 6 0 2 5 01 6　ＲＡＰＤ扩增扩增在ＰＴＣ - 51ＢＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＰＣＲ仪上进行 ,每 2 0 μｌ反应液中含 1 0ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ -Ｃｌ (ｐＨ 8 3) ;50ｍｍｏｌ/ＬＫＣｌ;3ｍｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ;2 0 0 μｍｏｌ/ＬｄＮＴＰｓ,0 2 μｍｏｌ/Ｌｐｒｉｍｅｒ,0 5ｕｎｉｔＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ及 4～ 40ｎｇ模板ＤＮＡ。反应条件为 :95℃ 5ｍｉｎ ,然后 94℃ 1ｍｉｎ ,35℃ 80ｓ,72℃ 2ｍｉｎ ,运行 40个循环 ,之后 72℃延伸 5ｍｉｎ。扩增产物用 1 6%琼脂糖凝胶电泳分离 ,溴化乙锭染色后 ,紫外分析仪上观察并照像。表 2　白菜、萝卜ＤＮＡ浓度 (ｎｇ/ μｌ)Ｔａｂｌｅ 2ＤＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅａｎｄｒａｄｉｓｈ (ｎｇ/ μｌ)种类 ＤＮＡ编号浓度(ｎｇ/ μｌ)ＤＮＡ编号浓度(ｎｇ/ μｌ)ＤＮＡ编号浓度(ｎｇ/ μｌ)ＤＮＡ编号浓度(ｎｇ/ μｌ)白菜 112 5 7— 13 10 0 192 5 02 2 5 0 810 0 14 10 0 2 0 12 53 2 5 0 915 0 15 2 5 0 2 1—410 0 10 130 16 30 2 2 2 5 05— 1115 0 172 5 0 2 3 2 5 06 12 5 12 12 5 1812 5 2 412 5萝卜 12 5 0 3 2 5 0 5 2 0 0 75 0 02 12 5 42 0 0 6 5 02　结果与分析2 1　提取液中ＣＴＡＢ浓度的确定以金乡白蒜贮藏鳞茎为ＤＮＡ提取材料为例 ,改变提取液中ＣＴＡＢ的浓度对ＤＮＡ提取的影响见表 3。表 3提取液中ＣＴＡＢ浓度对大蒜ＤＮＡ产量和质量的影响Ｔａｂｌｅ 3ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅＣＴＡＢｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎ ｙｉｅｌｄａｎｄｑｕａｌｉｔｙｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｇａｒｌｉｃＤＮＡＣＴＡＢ浓度(% ) 12 46ＤＮＡ产量(ｎｇ/ｍｇ鲜重 ) 2 6 45 5 0 5 1ＤＮＡ质量(Ａ2 6 0 /Ａ2 801 5 1 81 81 7由上表可看出 ,提取液中ＣＴＡＢ浓度在 2 %～ 4%之间ＤＮＡ产量较大 ,且纯度也较高。当ＣＴＡＢ浓度超过 4% ,ＤＮＡ产量的增加不再明显 ,且ＤＮＡ质量下降。这可能是由于清洗ＤＮＡ沉淀时ＣＴＡＢ易清除不干净造成的。当ＣＴＡＢ浓度低于 2 %时 ,ＤＮＡ产量和质量都明显下降。因此 ,提取液中ＣＴＡＢ浓度确定为 2 %～ 4%。2 2　液氮处理对ＤＮＡ提取的影响以金乡白蒜贮藏鳞茎为ＤＮＡ提取材料 ,比较液氮处理和无液氮处理所得ＤＮＡ的差别。我们发现 ,处理项除ＤＮＡ产量上有明显提高外(大约 2倍 ) ,与非处理项在ＤＮＡ质量上无明显差异。液氮处理能提高ＤＮＡ产量的原因可能是材料经液氮处理后变脆 ,从而使材料研磨得更为充分。为了简便操作 ,我们在大蒜ＤＮＡ提取时不再使用液氮处理。2 3　不同取样对ＤＮＡ提取的影响分别以金乡白蒜田间幼叶、室内黄化苗和贮藏鳞茎为样品进行ＤＮＡ提取。提取结果见表 4。表 4　不同取样对大蒜ＤＮＡ提取的影响Ｔａｂｌｅ 4ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓａｍｐｌｉｎｇｓｏｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｇａｒｌｉｃＤＮＡ田间幼叶室内黄化苗贮藏鳞茎ＤＮＡ产量(ｎｇ/ｍｇ样品 ) 6 0 15 0 5 0ＤＮＡ质量(Ａ2 6 0 /Ａ2 80 ) 1 81 81 8由表 4看出 ,室内黄化苗ＤＮＡ产量最高 ,其次是田间幼叶 ,最后是贮藏鳞茎。2 4　简化ＤＮＡ提取液成分对ＤＮＡ产量和质量的影响我们在提取液不加ＰＶＰ40和 2 -巯基乙醇 ,用此简化提取液分别提取金乡白蒜田间幼叶、室内黄化苗和贮藏鳞茎的ＤＮＡ。结果中可以看出 ,提取液的简化对贮藏鳞茎ＤＮＡ的提取影响不大 ,而田间幼叶和室内黄化苗提取的ＤＮＡ发生降解。可能是由于幼叶中核酸酶活性较高所致。2 5　不同大蒜品种提取ＤＮＡ的产量与质量差别应用该法对 60多个大蒜品种进行了ＤＮＡ提取 ,除个别品种 (澳引 9号 ,澳引 8号 )提取的ＤＮＡ呈一定降解状外 ,大部分质量很好 ,背景清淅 ,产量在 1 0～ 2 0 0ｎｇ/ｍｇ之间。2 6　用提取的ＤＮＡ作ＲＡＯＤ试验　　ＲＡＰＤ扩增对ＤＮＡ模板的要求不是很高 ,ＲＮＡ有无和带有少量蛋白质据认为不会影响扩增。但是一些多糖、酚类物质及色素等会严重影响Ｔａｇ酶的活性 ,从而导致扩增失败。大蒜组织中富含粘性多糖 ,ＤＮＡ不易提取 ,采用ＣＴＡＢ法可以有效地解决这个问题 ,并且不用液氮处理 ,省去打破休眠及室内发芽等步骤 ,所得ＤＮＡ的产量和纯度均能满足ＲＡＰＤ要求 (见图 1 )。图 1　大蒜ＤＮＡＲＡＰＤ试验Ｆｉｇ 1ＲＡＰＤａｓｓａｙｕｓｉｎｇｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｇａｒｌｉｃＤＮＡ说明 :1 ＤＮＡ标记 (ＬａｍｂｅｒｄａＤＮＡＭａｒｋ ｅｒ)。2 1 4个大蒜品种 (1 4ｇａｒｌｉｃＬｉｎｅｓ)。引物为ｏｐｒｏｎＮｏ 5CTAB法提取大蒜、白菜基因组DNA@曲士松$山东省农业科学院蔬菜研究所!济南250100 @刘宪华$山东省农业科学院蔬菜研究所!济南250100 @黄宝勇$山东省农业科学院蔬菜研究所!济南250100 @王淑芬$山东省农业科学院蔬菜研究所!济南250100 @徐培文$山东省农业科学院蔬菜研究所!济南250100DNA提取;;大蒜;;白菜;;CTAB〔1〕Doyle ,J J andDoyle ,J L ,Amer J Bot 1988,75 ,12 88 〔2〕Scotto ,O Rogers&ArnoldJ Bendch ,ExtractionofDNAfromplanttissues PlantMolecularBiologyMannul 1988 〔 3〕Murray ,H G Thomspon ,W F RapidisolationofhigherweightDNA NucleicAcidRes 1980 8,432 1

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