基于R-loop靶向编辑技术的R-loop功能位点高通量筛选系统
文献类型: 中文期刊
第一作者: 皮一飞
作者: 皮一飞;宋新辉;王淅琳;李谨谨;孙长斌;徐炜
作者机构:
关键词: 高通量筛选;耐药性;R-loop;定点调控;CRISPR/dCas9
期刊名称: 生物技术通报
ISSN: 1002-5464
年卷期: 2024 年 40 卷 010 期
页码: 181-190
收录情况: 北大核心 ; CSCD
摘要: [目的]开发哺乳动物细胞R-loop靶向编辑技术,探究其在肿瘤细胞耐药性研究中的应用.[方法]构建无酶切活性的Cas9 与具有R-loop水解活性的RNase H1 融合蛋白dCas9-RNaseH1 表达载体,用于实现对R-loop的靶向编辑.在HeLa细胞中稳定表达该融合蛋白,建立R-loop靶向编辑细胞模型.转染覆盖全基因组转录起始区域的sgRNA文库,构建R-loop筛选细胞库,筛选影响紫杉醇和顺铂耐药性的R-loop功能位点.[结果]筛选获得 744 个影响HeLa细胞耐药性的R-loop功能位点,覆盖了细胞周期、凋亡、信号传导等关键生物通路.其中,26 个位点使HeLa细胞对这两种药物产生耐药性,8 个位点使其对这两种药物敏感,提示可能存在共享的生物通路.功能验证显示,部分R-loop功能位点通过调节相关基因(如ZBTB20、SPON2、ACTRT1 等)的表达来影响HeLa细胞对抗肿瘤药物的敏感性.[结论]成功开发出适用于哺乳动物细胞的R-loop靶向编辑系统,并建立高通量筛选平台.
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