猪链球菌2型05ZYH33糖苷水解酶SSU05_1921和SSU05_1922的表达纯化及功能研究

文献类型： 中文期刊

第一作者： 卫东

作者： 卫东;高广娟;武柳君;朱金鲁;刘思国;刘冉;张跃灵

作者机构：

关键词： 猪链球菌2型05ZYH33;SSU05_1921;SSU05_1922;糖苷水解酶;高甘露糖型N-聚糖

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2022 年 44 卷 003 期

页码： 269-276

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株高甘露糖型N-聚糖水解酶的结构域及功能,本研究通过BLAST检索,发现该菌株中存在分别与肺炎链球菌高甘露糖型N-聚糖水解酶SpGH92和EndoD同源的蛋白,分别为SSU05_1921(后简写为1921)和SSU05_1922(后简写为1922).本研究通过原核表达系统和Ni-NTA柱亲和层析纯化,获得了1921和1922全长蛋白,以及1922蛋白的糖苷水解酶结构域1922-Cat.通过6个蛋白反应(不加蛋白的阴性对照、分别仅加1921和1922的蛋白反应2、3,同时加入1921和1922的蛋白反应4、5及同时加入1921和1922-Cat的蛋白反应6)的RNase B去糖基化试验,反应结束后分别通过SDS-PAGE及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析RNase B的水解(即去糖基化)产物,研究1921和1922水解高甘露糖型N-聚糖的功能.结果显示,1921为外切α-1,2-甘露糖苷酶,水解RNase B高甘露糖型N-聚糖末端的α-1,2-甘露糖苷键;1922为内切β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,水解RNase B高甘露糖型N-聚糖中的几丁二糖,作用位点为β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷键.且只有在1921去除所有的α-1,2-甘露糖苷键,1922才能彻底水解高甘露糖型N-聚糖.二者的联合作用(反应4)结果显示,在15 ku处出现单一条带,表明二者联合作用于RNase B的高甘露糖型N-聚糖后,将其彻底去糖基化为R-GlcNAc,且1921与1922-Cat的联合作用与上述联合作用结果一致,表明1922的主要催化结构域即为1922-Cat.因此选择1921与1922-Cat联合作用于RNase B的去糖基化反应研究不同pH、不同金属离子及EDTA和EGTA螯合物对该联合作用的影响.结果显示,该联合作用的最适pH为7.0~8.0,二价金属离子Cu2+、Fe2+、Ni2+、Co2+、Zn2+均明显抑制1921与1922-Cat的联合作用,Ca2+部分抑制该联合作用,而二价离子Mg2+、Mn2+和一价离子K+、Na+及二价金属离子螯合物EDTA和EGTA对该联合作用无明显抑制作用,表明1921和1922-Cat的联合作用不依赖于二价金属离子.本研究首次较详细探究了SS2高甘露糖型N-聚糖水解酶的功能和生化特性,为解析SS定植和感染过程中糖类营养物质获取的机制奠定了基础.

分类号： S852.61

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