MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

文献类型： 中文期刊

第一作者： 谢思豪

作者： 谢思豪;勾红潮;卞志标;李斌;蔡汝健;臧莹安;李春玲

作者机构：

关键词： MLKL基因;CRISPR/Cas9基因编辑技术;敲除;PK-15细胞;猪伪狂犬病病毒(PRV)

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2022 年 05 期

页码： 1934-1941

收录情况： 北大核心

摘要： 【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like, MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平；采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平；采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。

分类号： S852.65

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