多主棒孢SdhB-H278R突变位点AS-real-time PCR定量检测体系的建立

文献类型： 中文期刊

第一作者： 孙炳学

作者： 孙炳学;石延霞;朱发娣;谢学文;柴阿丽;李宝聚

作者机构：

关键词： 黄瓜;多主棒孢;AS-real-time PCR;抗药性;琥珀酸脱氢酶B亚基;啶酰菌胺

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2018 年 24 期

页码： 4647-4658

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】建立一种快速、高效、定量检测黄瓜多主棒孢(Corynespora cassiicola)琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)H278R突变的实时荧光定量PCR(AS-real-time PCR)检测方法,并进行效果验证。【方法】从北京市大兴区采集、分离纯化病原菌,获得24株多主棒孢的单孢菌株,采用菌丝生长速率法测定其对啶酰菌胺的EC50,随机选取4株敏感(S)和8株抗性(R)菌株测其菌丝生长速率、产孢量和致病性。采用引物对Cc-SdhB-F/R测定多主棒孢SdhB基因序列,检测SdhB的碱基变化。基于多主棒孢SdhB的相同核酸序列和SNP位点设计内参引物B-H278R-TY-F/R和特异性引物B-H278R-2F/2R14,建立并优化AS-real-time PCR定量检测体系,并对引物的特异性、熔解曲线和灵敏度进行评价。利用该体系分别检测含有H278R不同突变比例的DNA和孢子悬浮液。【结果】测定的24个菌株中,敏感菌株占66.7%,EC50值为0.057—0.563μg·mL~(-1);抗性菌株占33.3%,EC50值为5.395—11.710μg·mL~(-1)。抗性和敏感菌株仅在菌丝生长速率方面存在显著性差异,且菌丝生长速率与EC50之间存在显著负相关。在产孢量和致病性方面不存在显著性差异。测序分析发现抗性菌株均携带SdhB-H278R突变。本研究设计的引物B-H278R-2F和B-H278R-2F2R14特异性强,仅对多主棒孢SdhB-H278R突变菌株的DNA有扩增条带,对其余供试菌株均无条带扩增。普通AS-PCR检测的灵敏度为91 pg·μL~(-1),而AS-real-time PCR的灵敏度可达9.1 pg·μL~(-1),灵敏度为普通AS-PCR的10倍。以基因组DNA为标准品,构建的AS-real-time PCR标准曲线ΔCT值与相对模板浓度的对数有良好的线性关系,相关系数为0.9857,扩增效率为92.59%。熔解曲线吸收峰单一,内参引物B-H278R-TY-F/R和特异性引物B-H278R-2F/2R14分别在87.81℃和91.62℃处出现单一特异性峰。用DNA和孢子悬浮液对标准曲线进行验证,结果表明随着相对模板浓度逐渐降低,该检测体系的准确性逐渐升高且检测下限为5%,同时预期值与试验值呈线性相关(R~2=0.9998和R~2=0.9922)。【结论】建立了一种高效、定量、快速的AS-real-time PCR检测体系用于SdhB-H278R突变位点的检测,可为杀菌剂的抗性治理提供理论依据。

分类号： S436.421

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