大肠杆菌双质粒CRISPR-Cas9系统的优化及应用

文献类型： 中文期刊

第一作者： 王凯凯

作者： 王凯凯;王晓璐;苏小运;张杰

作者机构：

关键词： CRISPR-Cas9系统;大肠杆菌;基因编辑;双质粒系统

期刊名称： 生物技术通报

ISSN： 1002-5464

年卷期： 2021 年 012 期

页码： 252-264

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 近年来,CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）基因编辑系统已经成功应用于多种微生物中。由于CRISPR-Cas9系统仅受PAM（protospacer adjacent motif）位点NGG的限制,因此理论上CRISPR-Cas9系统可以编辑基因组中任何含NGG的位点或基因,但研究发现该系统对影响微生物生长及代谢的关键靶基因改造时会出现效率降低,甚至是无法获得突变株的现象。前期已有大量研究报道了降低CRISPR-Cas9系统脱靶效应的策略,但依然未能有效解决编辑效率降低的问题。因此,本研究通过使用不同拷贝数的质粒调节Cas9、gRNA的表达和同源臂浓度使其协同发挥基因编辑功能,建立了更加高效的双质粒CRISPR-Cas9系统。试验结果表明,该系统对大肠杆菌pfkA（6-phosphofructokinase isozyme 1）、pfkB（6-phosphofructokinase isozyme 2）、zwf（glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase）单基因敲除最高效率达到100%;在nagABE基因簇位点通过替换引入甘油激酶基因glpK（glycerol kinase）的效率为10%。相比于单质粒CRISPR-Cas9系统,优化的双质粒系统成功进行了pfkB基因的敲除及glpK基因的整合,且将pfkA、zwf基因的敲除效率分别提升了31%和63%。突变株与野生株之间碳源代谢的差异进一步表明基因敲除效率与基因特殊活性相关。结果证明,过量的靶基因同源臂和gRNA的过表达可以有效提升CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌中的编辑效率。

分类号： Q78

  • 相关文献

[1]CRISPR-Cas9基因编辑技术在牛、羊生产中的应用研究进展. 潘东霞,王辉,熊本海,唐湘方. 2024

[2]利用CRISPR-Cas9系统定点突变猪MSTN基因的研究. 张冬杰,刘娣,张旭,汪亮,杨国伟. 2016

[3]CRISPR/Cas9系统在水稻基因组编辑中的应用. 唐秀英,王会民,龙起樟,黄永兰,芦明,万建林. 2017

[4]CRISPR/Cas9基因编辑技术在线虫中的应用进展和展望. 曹绪文,张留所. 2018

[5]利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对CSSL37的YSA基因进行定点编辑. 杨德卫,郑向华,项光海,曹源伟,程朝平,叶宁,黄凤凰,王皓毅,叶新福. 2018

[6]CRISPR-Cas9技术在作物中研究进展. 薛永国,刘鑫磊,唐晓飞,曹旦,栾晓燕. 2020

[7]动物转基因高效表达策略研究进展. 赵旭东,黄永志,毕延震,董发明. 2020

[8]CRISPR/Cas9系统在作物基因组编辑中的研究进展. 高丽,渠晖,王丽华,刘言龙,李艳阳,詹秋文,李杰勤. 2018

[9]CRISPR/Cas9基因编辑技术及在农作物品种改良研究中的应用. 郝丽芬,房永雨,燕孟娇,皇甫海燕,宋培玲,贾晓清,皇甫九茹,李子钦,韩冰. 2017

[10]植物合成生物学研究进展. 张博,马永硕,尚轶,黄三文. 2020

[11]丝瓜LcPPO1基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建. 陈敏氡,王彬,刘建汀,叶新如,曾美娟,朱海生,温庆放,康玉妹. 2021

[12]利用基因编辑技术进行猪异种器官移植及人类疾病模型研究的进展. 陆新章,张梅,娄颜坤,马育芳,李大力. 2021

[13]利用CRISPR/Cas9技术研究玉米Zm FKF1在开花过程中的作用. 杨敏,胥华伟,王翠玲,杨护,魏岳荣. 2021

[14]基因编辑技术及其在桑树育种中的应用前景展望. 黄锦,李勇,于翠,朱志贤,莫荣利,董朝霞,胡兴明,邓文. 2021

[15]CRISPR/Cas9技术及其在猪基因编辑中的应用. 刘思远,卢丹,唐中林. 2020

[16]鳞翅目昆虫基因编辑技术研究进展. 程英,靳明辉,萧玉涛. 2020

[17]花粉管通道和农杆菌介导的花生AhFatB基因编辑. 潘雷雷,纪红昌,黄建斌,淮东欣,雷永,隋炯明,唐艳艳,朱虹,姜德锋,王晶珊,乔利仙. 2020

[18]用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建. 张纪文,王露露,李芳,刘杏,赵东明,步志高. 2020

[19]基因编辑技术在提高猪瘦肉率中的应用. 任红艳,王紫君,舒畅,华再东,毕延震. 2020

[20]基因编辑技术在番茄育种中的应用进展. 王娟,王柏柯,李宁,杨涛,帕提古丽·艾斯木托拉,余庆辉. 2020

作者其他论文 更多>>

微信小程序