TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测西瓜潜隐病毒

文献类型： 中文期刊

第一作者： 赵立群

作者： 赵立群;邱艳红;张晓飞;刘慧;杨静静;张建;张海军;徐秀兰;温常龙

作者机构：

关键词： 西瓜潜隐病毒;实时荧光定量PCR;TaqMan探针法;葫芦科作物;种传病害

期刊名称： 中国农业科学

ISSN：

年卷期： 2021 年 020 期

页码： 4337-4347

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】西瓜潜隐病毒（Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV）是近年来新发生的一种重要种传病害,研究旨在建立基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes,TaqMan-qPCR）检测技术,为开展种子、种苗带毒鉴定和病害防控提供技术支撑。【方法】通过基于小RNA高通量测序技术在北京西瓜产地发现了CiLCV,并克隆CiLCV的dsRNA1和dsRNA2全长序列,设计特异性引物建立RT-PCR和TaqMan-qPCR检测方法。以黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottled mosaic virus）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus）、甜瓜内源病毒（Cucumis melo endornavirus）、瓜类褪绿病毒（cucurbit chlorotic yellows virus）、南瓜花叶病毒（squash mosaic virus）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus）、西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus）、小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus）8种常见病毒为对照进行检测方法特异性分析;利用建立的实时荧光定量标准曲线对方法灵敏度进行评价;进一步利用TaqMan-qPCR和RT-PCR技术监测我国葫芦科作物主产区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜（砧木）种苗带毒情况。【结果】通过分析获得的高质量小RNA数据,发现17条组装的contig与CiLCV基因组有较好同源性。进一步克隆获得CiLCV的dsRNA1和dsRNA2序列全长（分别为1 603和1 466 nt）,发现其与河南省鉴定出的CiLCV同源性高达99.4%和99.8%（GenBank number KY081285、KY081284）。建立的RT-PCR检测技术对CiLCV有单一扩增条带;建立的TaqMan-qPCR检测技术具有较好特异性和灵敏度,且能够检测到最低拷贝数为2×103的病毒,灵敏度是RT-PCR的100倍。同时,发现有1份来自北京的西瓜种苗检出了CiLCV,而其余地区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜（砧木）种苗均未检出该病毒,表明我国葫芦科作物主产区种苗带毒情况总体不高。【结论】建立的TaqMan-qPCR检测CiLCV技术特异性强、灵敏度高,适用于口岸和实验室开展CiLCV快速检测和精准鉴定。鉴于CiLCV可以通过种子、种苗等传播方式快速扩散,我国应重视种子、种苗的带毒检测,防止带毒种子、种苗流入生产环节进而调运扩散至全国,给产业造成重大经济损失。

分类号： S432.41

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