RALY基因敲除PK-15细胞系的构建及对口蹄疫病毒复制的影响

文献类型： 中文期刊

第一作者： 张林

作者： 张林;吴金恩;任玫;王学飞;李硕;王嘉宁;魏凡华;郭慧琛

作者机构：

关键词： CRISPR/Cas9;RALY基因;基因敲除;口蹄疫病毒

期刊名称： 中国兽医科学

ISSN： 1673-4696

年卷期： 2023 年 53 卷 009 期

页码： 1115-1121

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 利用CRISPR/Cas9 技术建立敲除RNA结合蛋白(RALY)基因的PK-15 细胞系PK-15-RALY-/-,并初步探究RALY对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响.根据GenBank中猪的RALY基因的外显子,设计合成sgRNA并克隆至PX459 载体;将质粒转染PK-15 细胞,并采用有限稀释法筛选单克隆细胞株,经West-ern-blot及测序检测RALY基因的敲除效果.通过RT-qPCR检测FMDV感染PK-15-RALY-/-和PK-15 细胞后FMDV mRNA的转录水平,Western-blot检测FMDV-VP0、FMDV-VP3 和FMDV-VP1 的表达水平,最后检测子代病毒感染力.测序结果证实RALY基因发生了移码突变,且Western-blot无法检测到PK-15-RALY-/-细胞中RALY蛋白的表达.FMDV感染两种细胞后,RT-PCR结果显示,FMDV在PK-15 细胞中的mRNA水平显著低于PK-15-RALY-/-细胞,Western-blot结果显示,VP0、VP3 和VP1 蛋白在PK-15-RALY-/-细胞中的表达显著高于PK-15 细胞,病毒感染力测定结果显示,PK-15-RALY-/-细胞中子代病毒滴度显著高于PK-15 细胞.上述结果表明,本研究成功构建了RALY基因敲除的PK-15 细胞系,首次表明RALY可以抑制FMDV复制,为进一步开展RALY在细胞内调控病毒复制机制研究奠定了基础.

分类号： S852.659.6

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