文献类型： 中文期刊

第一作者： 李建凡

作者： 李建凡

作者机构：

期刊名称： 中国禽业导刊

ISSN： 1008-0619

年卷期： 2000 年 18 期

页码： 12-13

摘要： 家禽分子生物学研究近 10年来有了长足进步，在某些方面取得了突破。下面将近年来的进展作一概述。 　　一.遗传标记和基因定位 　　传统的育种方法一直是根据家禽所表现出的生产性能来选育良种，因而费时费力，选择和培育一个良种往往要几年的时间。因此，长期以来人们就想到一些物质，它们在不同个体或群体中是不完全相同的，其差异可用简单的方法进行鉴别，而用来区别不同的个体或群体。这种物质又是简单稳定遗传的，能代表该个体或群体的遗传特性，这样的物质叫做遗传标记。如果能找到某些遗传标记与家禽的某种生产性能相关连，便可利用其进行家禽的早期选育。 　　80年代初期出现的 DNA限制性片段长度多态性 (RFLP)技术，即可用作遗传标记对家禽品质特性进行早期选育。在染色体 DNA上，每个限制性内切酶存在着多个酶切位点。用各种酶可将它切成许多长度不同的片段。遗传变异可能造成不同个体的 DNA酶切位点有所不同，酶切后不同个体产生的 DNA片段长度也不同，并可用分子杂交和电泳技术使这种差别显示出来。这就是限制性片段长度多态性技术。如果电泳图谱中的某些条带与家禽某种遗传特性相连锁，找到相应的遗传标记，就可以比较容易地进行早期选育了。这一技术开始是用于诊断人的遗传疾病。 Soller等 (1986)详细讨论了它在家禽育种上的应用，包括 RFLP技术、测定 RFLP与品质特性位点 (QTL)连锁的方法，并探讨了 RFLP与 QTL连锁信息在家禽育种上的应用。 　　Hillerl等 (1989、 1990)发现在鸡品系内和品系间存在高变异的微卫星 DNA序列，在某些情况下，它与具有商业意义的品质特性相连锁，如与鸡体脂肪的含量有关。 Bumstead等 (1992)从两个鸡的近交系回交后代中构建了具有 DNA在 DNA克隆试验中的变异达 40％，但这一连锁图谱仍可用于具有商业意义的重要品质性状 QTL的定位。 　　分析 DNA酶切片段长度多态性的另一方法是 DNA指纹技术。其基本原理与 RFLP相同，只是它们使用的探针不同。 DNA指纹技术所用的探针是染色体 DNA中某种重复序列杂交的探针，因而显示出来的酶切后长短不一的含有该重复序列的片段。已证明这种重复序列次数发生的频率要比酶切位点的变异高很多倍。 Lamont等 (1993)用 DNA指纹技术研究了产蛋鸡品系中 QTL遗传标记。所用的品质性状指标包括体重 (BW)、蛋重 (EW)、蛋壳色度 (CS)、穿刺记分 (PS)、破裂记分 (BS)、白蛋白高度 (AH)、开产日龄 (E1)、成熟至 32周龄产蛋率 (％ E－ 1)、第一阶段总产蛋数 (TE－ 1)、 40－ 52周龄产蛋率 (％ E－ 2)和第二阶段总产蛋数 (TE－ 2)。在两个商品鸡品系再进行回交产生的组群中，利用指纹技术，发现 56条电泳与 11个性状指标有关。 　　与 QTL连锁的 DNA指纹图可用来获得位点特异性探针和位点特异性聚合酶链反应 (PCR)引物，它们可用于遗传标记选种。 DNA标记 QTL连锁仅是用于鉴定和分离 QTL的开始，由此还可以得到等位基因特异性探针和引物。它们可用于组群的选育，并可以帮助人们对 QTL生物活性和生理遗传关系的进一步了解。孟安明等人 (1993)为利用 DNA指纹技术解决畜牧业生产问题做了不少工作。已做出鸡、鸭、牛、猪等畜禽的 DNA指纹图，表明能用来区分畜禽个体和准确判定亲子关系。目前正在利用 DNA指纹图寻找与某些生产性能相连锁的遗传标记。 　　由于有了以上技术，鸡的基因定位工作正在加速进行。鸡基因组的大小为 1.2× 10－ 9bp， DNA可从红血球中分离，为用 DNA作基础的基因定位提供了方便。 1992年在瑞士召开了第 23届 ISAG会议，会上达成了进行鸡和其他禽类基因定位合作的协议。目前已有 400多个位点得到定位，将来的重点是用微卫星标记绘制综合基因图谱。 　　二.禽病防治研究 　　1.遗传标记抗病选育 　　Gavora(1990)等人对此作了有益的尝试。 Bacon(1987)和 Dietert(1991)提出一类与家禽抗病性有关的遗传标记，并可用免疫学方法和分子生物学技术进行检测，这就是主要组织相容性复合物基因。 Crittuden(1991)提出，反转录病毒代表另一类遗传标记，可用作抗病性状的选育。此外，限制性片段长度多态性 　　2.抗病基因转移技术 和 DNA指纹技术，也可用作抗性选育遗传标记 (Knhnein等， 1991)。 　　用适当的方法将外源抗病基因转至家禽体内，使之获得抗病性，是防治禽病的一条途径。 Crittenden等人 (1992)首先利用病原－介导抗性，将重组禽白血病病毒基因转至鸡体内，小鼠 Mx基因可诱导生成干扰素，可干扰 Orthomy Xo病毒的复制和防止病毒性流感。 Garba等人 (1991)将这类基因 MxⅠ转至鸡细胞中，使鸡获得了对家禽流感的抗性。利用反义 RNA防治疾病也是一种分子生物学方法。反义 RNA是一种小分子 RNA，它可与正常 mRNA互补，使其不能翻译成蛋白质。反义 RNA不仅存在于原核体系中，也存在于真核生物中。反义 RNA可阻止反转录病毒的复制。 Kmamura等人 (1991)用与马立克病毒 mRNA互补的一段寡核苷酸 (反义 RNA)抑制转化淋巴细胞的增殖，因而将反义 RNA片段转至鸡染色体中，也可使鸡获得抗病性。 80年代的重大发现之一是发现了核酶 (Ribozyme)，这是一种结构特殊的 RNA。其催化作用的化学本质与蛋白酶一样。一种核酶只特异性地切割一种 RNA。因而可以按照要切割的 RNA，包括病毒和某些有害基因转录产生的 RNA，来设计并合成出核酶，然后将它导入动物体内就能起到防病治病的作用，目前国内已有人研究这类工作。某些自然存在的寡核苷酸也和反义 RNA相似，具有选择性控制基因表达的功能如果整个 DNA的糖－磷酸骨架被聚胺链所替换 (Nielseu等， 1991)，这样经化学方法得到的化合物可能会用于预防和治疗禽类疾病。 　　3.病原体检测技术 　　DNA探针和聚合酶链反应技术，提高了禽病总体检测的精确度，从而有利于对疾病的预防和根冶。如近年来对传染性喉气管炎病毒。支原体和家禽传染性支气管炎病毒的检测，都取得了很好的 效果。 　　4.基因疫苗和亚基因疫苗 　　分子生物学技术可以生产只含有有效免疫组分的疫苗，而不含全部细菌和病毒，这样它在使用时就更安全。还可制成多价疫苗，因而它很有发展前途。近年来生产的基因工程疫苗有马立克氏病疫苗 (Yanagida等人， 1992)、传染性法氏囊病疫苗、堆型艾美耳球虫和禽冠状病毒等病的疫苗。 　　三.家禽转基因研究 　　与其他转基因动物相比，转基因鸡的研究具有更加引人注目的意义。鸡个体小，繁殖快，世代交替也快，不仅具有经济价值，同时也是一个理想的实验动物。但是，由于鸡的受精卵有卵黄包围，位于胚盘中央，从受精到产出时已经过 24小时，发育到 9－ 10阶段，此时的细胞数目多达 60， 000－ 80， 000个，进行外源 DNA注射显然是太晚了，根本不能与细胞中染色体整合。因而转基因鸡的技术和转基因哺乳动物相比更加困难。在 80年代初， Grittenden等人用反转录病毒，即禽白血病病毒 (ALV)作载体，感染刚产出的受精卵的胚盘，使外源基因通过病毒的感染而插入到鸡的染色体中，得到了转基因鸡。后来许多人也得到同样的结果。但这一方法具有很多缺点，如插入基因的长度受到限制，制备高效感染病毒也很困难。另外，用病毒作载体得到的转基因鸡，使消费者立即想到这种鸡本身是否染上了这种病毒，对它产生了排斥心理，很难为消费者所接受。到 1990年以后，这种方法就逐渐为其他方法所代替。 　　1.单细胞阶段的显微注射法 　　Perry(1988)成功地将鸡受精卵从单细胞开始在体外进行培养，这一技术为在单细胞阶段进行显微注射生产转基因鸡打下基础。 Naito等人 (1993)将带β－肌动蛋白启动子的β－乳糖苷酶 (LacZ)基因，用显微注射法注入单细胞阶段鸡受精卵胚盘中。 263个注入外源基因的蛋 4日龄的成活率为 48.7％，孵化率为 11.8％。得到了 19只公鸡和 6只母鸡，并达到性成熟。取其血液和精液进行分析，得到两只 DNA阳性公鸡。为了测定两只公鸡与母鸡交配。其中一只公鸡 (W－ 9266)得到 75只后代，另一只公鸡 (W－ 9273)得到 34只后代。但经测定在这些后代中没有发现外源 DNA存在。 　　英国爱丁堡 AFRC Roslin研究所 Jamie等人在 1993年 8月首次报道了他们的研究成果。他们将带有报道基因的质粒 DNA微注射入鸡受精卵的胚盘中，体外培养 12小时后分析存活的胚胎，发现近一半胚胎含有质粒 DNA。在所有组织分析中，有 6％相当于每个细胞有一个拷贝。有 7个小鸡 (占注射受精卵总数的 5.5％ )成活至性成熟，其中一只未满一年的小公鸡将 3.4％的外源 DNA传给其后代。这些鸡达到性成熟，并繁殖了子代基因鸡。这一实验证实了微注射能将外源 DNA稳定地导入种系中。 　　2.脂质体介导精子作载体导入外源基因法 　　Rottmann(1992)将新采集的鸡精液，用 Krebs Ringer溶液洗涤 3次，取 1毫升精子悬浮液 (120× 10－ 6精子 )与 500微升脂质体悬液混合，脂质体含有质粒 DNA。在 37℃下保温 30分钟，混合物用作人工授精。每只母鸡输入 100微升精子－脂质体悬液。每日早上收集鸡蛋，在 37℃下孵化 12天。取 158个经 12天孵化的鸡胚进行了外源 DNA分析，有 41个 (26％ )含有外源基因。但进一步研究证实， DNA没有完全整合到鸡胚染色体中，而是处在“游离”状态。由于这一方法操作简单，很可能成为生产大批转基因鸡的方法。 　　3.嵌合体鸡的制备——一种转基因方法 　　Etohes等人 (1993)报道了一种间接地制备转基因鸡的方法。他们用两只处在同一发育阶段的芦花鸡和莱航鸡的受精卵 (蛋 )，分别作为供体和受体。在进行细胞微注射之前 1小时，将受体蛋用γ－射线照射 490－ 620拉得剂量，然后将供体蛋细胞取出，用微注射器直接注入受体蛋胚盘中央。将蛋壳封住后在 37℃下进行孵化。他们用这一方法得到了三只具有芦花鸡黑白点羽毛色的由莱航鸡蛋孵出的嵌合鸡。基于这一结果，他们提出了下面转基因路线：把供体鸡胚细胞取出后进行人工培养，再以适当的方法用外源基因转染这些细胞。经过筛选，可分离出含有外源基因的鸡胚细胞。经这样处理后，把这些鸡胚细胞再注入到受体蛋胚盘中，可以得到与上面相同的嵌合鸡。此时的嵌合鸡应当带有外源基因。用这种方法就可以制备转基因鸡。由于鸡胚细胞培养较困难，这一方法仍然处在研究阶段，后来的工作 (Thorayal等， 1994)也得到了用黄色和白色莱航鸡制备的嵌合鸡。 　　四.性别鉴别和性别控制 　　在自然条件下，畜禽繁殖的后代基本上是雌雄各半，然而人们却希望得到较多的雌性或雄性畜禽。如在商业育种上往往要得到产蛋或产肉鸡。蛋业要求较多的母鸡，若能改变公母比例，自然可以大大提高经济效益；而那些生产鸡肉的企业，则希望更多的雄性。因而家禽性别控制引起了极大的兴趣。性别的鉴别首先在家畜上取得了突破，但在家禽上却研究较少。主要是决定家禽性别的因素更为复杂。 　　从根源上讲，非整倍体是自然性别决定的主要信息来源。最重要的是 XO和 XXY非整倍体。在果蝇中，非整倍体 XO是雄性，说明 XY整倍体中的 Y染色体不能决定雄性的基因型；同样 XO非整倍体在人类则是雌性，说明 Y染色体在决定雄性基因型时起重要作用。与这模型一致， XXY非整倍体在果蝇中是雌性而在人类是雄性。许多非整倍体和多倍体曾在家禽中有所报道。 McCarrey等 (1979)总结了决定家禽性别的因素。如下表： 　　Haleerson等 (1993)综述了鸟类性别决定的基因控制。提出鸟类性别决定于 Z染色体与常染色的比例并受细胞自发性和激素水平的调控。用于鉴别非整倍体和染色体变异的方法是用染色体上一段特异性序列与染色体基因杂交，并将杂交图谱与标准雄性或雌性图谱进行比较而知。某些 DNA序列 (探针 )已用于性别的鉴别。 Jones与 Singh(1985)从蛇的 W染色体中分离到一个简单重复的核苷酸序列 Bkm，这一序列也与某些鸟类性染色体相关。 Tone等人 (1982)从家禽的 W染色体中也分离出了另一个重复序列 Xhol，而且可用点杂交的方法从群体中快速筛选 W染色体的变异。后来 Dorak等 (1992)从火鸡胚 cDNA文库中克隆到一段保守序列 cDNA， PMgI。它存在于 W染色体的分化区。 PMgI则可用家禽性别的鉴定。 　　家禽分子生物学的研究正处在发展时期，虽有了许多进展，但仍有许多问题需要深入研究，和其他动物相比，发展仍然较慢，目前已引起广大科学家的重视，预计在不久将取得重大突破。□ 家禽分子生物学技术研究进展@李建凡$中国农业科学院畜牧研究所!北京 100094

分类号：