文献类型： 中文期刊

第一作者： 蔡少华

作者： 蔡少华

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期刊名称： 中国蔬菜

ISSN： 1000-6364

年卷期： 1984 年 1 卷 01 期

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摘要： 自1890年Behring发现抗体以来,免疫学家们曾经为获得单特异的抗体做过许多努力,均未取得成功。直到1975年Kohler和Milstain才成功地将经过绵羊红细胞(抗原)免疫的并已产生抗体的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在融合剂──仙台病毒的作用下融合。以后再经筛选和分离纯系,得到了兼有两种亲本细胞特性的细胞系,就是所谓“杂交瘤细胞系”。即它们既具有骨髓瘤细胞能在体外以人工方法大量繁殖的特性,又具有经过免疫的小鼠脾细胞能分泌抗体的特性。这种由杂交瘤细胞纯系所分泌的抗体,被称为“单克隆抗体”。杂交瘤技术的发展使大量制备具有单一特性的纯系抗体成为可能。由于它能获得针对单一抗原决定簇的抗体,使这项新兴技术在短短几年之内深入到生物科学的很多领域,被誉为免疫学上的一项革命性新技术。从杂交瘤技术和单克隆抗体已经取得的成就和发展前景来看,它必将在免疫学、病毒学、分子生物学、药物学、肿瘤学以及农作物(包括蔬菜)育种学等许多学科领域的理论和实践上引起变革和产生深远的影响。下面简要介绍其优点、在植物病害检测和抗病育种中的应用,基本方法、所需仪器、国内研究现状和发展趋势。 一、杂交价技术和单克隆抗体的优点 单克隆抗体的特异性强,它不仅可以准确地进行病毒、细菌以及其它抗原的诊断,而且可用于病毒的株系、细菌的生理小种或畜、禽病害的亚型诊断。这是一般常规抗血清所不能胜任的。 在对抗原纯度的要求方面,不纯的抗原同样可以制备高纯度的单克隆抗体。对于那些难于提纯或抗原含量低的材料同样易于制取大量的单克隆抗体。再者无论高亲和力或低亲和力的抗原,甚至半抗原均可大量生产单克隆抗体。 单克隆抗体还具有一次研制,无限生产的优点。一旦针对某种抗原的杂交瘤培育成功,并注意保持其该杂交瘤细胞、系分泌抗体的能力,就可以长期地源源不断地制取该抗原的单克隆抗体。 M、条空泡技术和单克隆抗体在植物病害诊断及抗病育种申的应用 用植物病毒、细菌、菌原质和螺旋体等作为抗原均可制备单克隆抗体,并用于病原的诊断和抗病育种等方面。其研究起步虽较医学晚,但发展比较快。西德的Dietzsen等人于1982年研制出烟草花叶病毒(TMV)两个株系的单克隆抗体。瑞士的Gugurli于同年研制出马铃薯Y病毒、(*VY)三个株系的单克隆抗体,并同(国际马铃薯中心)有关专家合作,将其用于马铃薯抗病育种中筛选免疫或高抗单株及实验室**Y株系的诊断。美国菌种保存中心的徐惠迪已研制出大麦黄矮病毒(bydy)、苹果花叶病毒(APMV)和首%花叶病毒(AMV)等九种病毒的杂交瘤细胞系和单克隆抗体,并将用于病毒及其株系的诊断。美国夏威夷大学植病系教授 AnneAlvarez＄IJ备了柑桔溃疡病的病原细菌的几类单克隆抗体,可检测该细菌的生理小种。噬细胞,所用细胞密度为 2 x 10’ml,对96孔培养板,每孔加0.lml,24孔培养板,每孔加0.sml饲细胞悬液。有的实验室不加饲细胞,其杂流瘤细胞同样也长得较好。 (4)培养基及培养条件骨髓瘤细她将其用于检测墨西哥8个州的柑桔溃疡病细菌的生理小种,并进行病害流行规律分析,终于追踪到该病害的侵染源均来自同一苗圃,这一检测结果对防治实践有重大的指导意义。 此外,应用杂交瘤技术制备昆虫病毒、植物的类苗质体、螺旋体等的单克隆抗体都正在研究或已研究成功,并将用于生产防治或病害的预测预报。 三、杂交旧技术和单克隆抗体的制备 杂交瘤技术和单克隆抗体的制备程序可见示意图,现简介如下。 (一)用于杂交瘤技术的实验 材料及培养条件。 (1)实验动物的选择常 用于细胞融合的骨髓瘤细胞来自 BALB/c /J’鼠,一般也选用该小 鼠作为免疫和大量生产抗体的实验 动物。 (2)骨髓瘤细胞供细胞 融合用的骨髓瘤细胞应当是不能合 成自身免疫球蛋白轻、重链,而且 缺乏次黄瞟吟磷酸核糖核着转换酶 (HGPRT)或胸腺哆咤核苦激酶 (TK)的细胞。目前国内外实验 室均采用来自BALB八小鼠的骨 髓瘤细胞系,用得较多的细胞系有 SP 2/0和P 3/NSI/1—Ag 4 ,一1(简称NS—1)。 (8)饲细胞为促进杂交 瘤细胞正常生长繁殖,可在培养孔 中加入适量饲细胞。一般采用同 一品系正常小鼠腹腔中的巨胞和杂交瘤细胞的常用培养基为RPMI—1640培养基或DMEM培养基。在临用前还需加人10一15%灭活的胎个血清,国内大多用初生小牛血清代替。 培养条件,对融合后的细胞及杂交瘤细胞均置于37 t,湿度饱和的CO。培养箱中培养,箱内CO。浓度通常调节至5—7 %。 (二)免疫 一般对每种抗原同时用3—4只BALB/C小鼠免疫注射。注射剂量为60—300微克,随病毒种类而不同。加等量福氏完全佐剂乳化,大多免疫三次,间隔7天。第三次免疫在细胞融合前三天进行,大多采用尾静脉注射。 (三)细胞融合 细胞融合是制备单克隆抗体的关键步骤。融合方法随每个实验室的条件和操作习惯而略有不同,但一般都用聚乙二醇作为融合剂,分子量多为1000—2000,也有用分子量4000的。 融合前先杀死免疫过的小鼠,在无菌条件下取脾脏,用注射器将DMEM培养液注人脾脏,使脾细胞冲出制成细胞悬浮液,静置 5分钟后将上部的细胞悬液移人50ml锥形塑料管中。 分别将10‘脾细胞和10v骨髓瘤细胞置于50ml锥底离心管中,室温下5009离心7分钟,弃上清波,用手指轻击离心管底部使沉淀细胞混。匀然后将其放在37 t水浴中,在 1分钟内缓缓加人已预热至37 t的50%的聚乙二醇0.sml,静置1分钟后,再在1分钟内缓缓加人lml无血清的DMEM培养&,在5分钟内再加入20ml无血清的DMEM培养液,室温条件下离心2009,10分钟。将细胞沉淀再悬浮于48ml含有20%牛血清的 DMEM培养液中,再用同一培养液稀释一倍,最后加人到24孔培养板中,每孔2 ml。将培养板放在37t、含5%CO。且潮湿的培养箱中培养。 (四)杂交瘤细胞的筛选 在上述细胞融合后的细胞群体中,除我们所需要的能分泌抗体的杂交瘤细胞外,还可能产生骨髓瘤细胞间融合或脾细胞间融合而成的四倍体细胞,以及未融合的骨髓瘤细胞和牌细胞。后面的四类细胞都应被汰除。用加有次黄瞟吟(H)氨基噗岭(A)及胸腺使咤核苦(T)的选择性培养液(HAT)即可达到汰除的目的。只有杂交瘤细胞能从脾细胞中获得次黄源吟鸟源吟磷酸核糖苦转换酶,故能在含有HAT的培养基中通过补救途径合成核酸而继续生长繁殖。 (五)杂交瘤细胞培养中特异性抗体的检测 当融合后的细胞在含有HAT的选择性培养基中培养2—4个星期后,杂交瘤细胞几乎布满整个培养孔肘,应及时取培养上清液,检测是否产生针对用于免疫的抗原的特异性抗体。同时以免疫过的小鼠的阳性血清或已知其抗体为阳性的杂交瘤细胞培养的上清液为阳性对照。以健康小鼠血清作为阴性对照。目前检测植物病毒为抗原所制备的单克隆抗体大多采用酶联免疫吸附测定(ELJSA)的间接法,也可采用放射免疫测定法。 (六)杂交瘤细胞的单克隆化 杂交瘤细胞的单克隆化就是将能产生特异性抗体的培养孔内的细胞进行单细胞无性繁殖。为保证单个细胞所繁殖起来的杂交瘤细胞系分泌的抗体的纯一性,通常需要至少做两次单细胞的无性繁殖。一般采用有限稀释法或软琼脂法。 (1)有限稀释法将经抗体检测为阳性的培养孔中的培养液经过离心等处理后,加入新鲜培养液,计算其细胞含量,再将杂交瘤细胞稀释至每毫升培养液中分别合1.50或500个细胞等不同密度,再分装至96孔培养板中,每孔0.lml。或者将细胞用培养液稀释至每3个培养孔含有1个细胞的密度。通常采用后一稀释法者较为普遍。经过1—2星期培养后,对其中检测抗体为阳性的培养孔再做第二次单细胞繁殖。繁殖后将其中一部分细胞置液氮中冻存。 (2)软琼脂法用二倍浓度的完全培养基配制成0.5%和0.3%的琼脂。先倒入0.5%的琼脂 5 ml于直径60mm的培养皿中,再倒入一层0.3%的琼脂4ml(其中每毫升混合有1,000个或10,000个拟做单细胞无性繁殖的杂交瘤细胞悬浮液0.1毫升)。然后将培养皿移入含5—7%CO。的37℃孵箱中培养。每2—3天检查一次,当出现肉限可见的单个细胞团时,立即用巴氏管将其分别挑出并移人96孔培养板的孔内,标明各个单克隆的编号。继续培养繁殖后,再重复一次上述单克隆程序。 (七)细胞的冷冻保存与复苏 目前各实验室多采用液氮(- 196 t)保存细胞,常用冷冻保存剂为二甲基亚矾。方法是在细胞生长旺盛、细胞计数达10’/ml、活细胞不少于90%肘,将其离心,于沉淀中加入合10%二甲基亚矾的完全培养液3 ml,混匀后将细胞悬液分装至无菌安额或特制的冷冻保存小管中,每安瓶(或小管)装lml,封好,置衬有泡沫塑料的保温杯 (或瓶)中,充以少量液氮,置冰箱内过夜,或直接将安瓶(或小管)放在一80℃超低温冰箱中过夜,再放人液氮中保存。 细胞的复苏从液氮中取出安瓶(或冷冻小管)后立即放入37℃水浴中约30一4o秒钟,待其中冰凌融化后,先酒精炼试,再打开安瓶并把细胞悬液吸至盛有5ml完全培养液的离心管中,低速离心后,加Zml完全培养液至沉淀中摇匀后转入培养瓶内置CO。孵箱中培养。 (,\)单克隆抗体的大量生产 杂交瘤细胞经两度单克隆化,并再经几次传代培养后,所得到的分泌特异性抗体的细胞系已趋稳定,可进行单克隆抗体的大量生产,目前多采用BALB/C,J’鼠生产腹水抗体,也可采用大量培养法。 (1)BALB/C,]’鼠生产腹水抗体先给鼠腹腔注射Pristane(降植烷), 1—2星期后再腹腔注射杂交瘤细胞约10’一10’个,经2—3星期后即产生大量腹水,可抽取经离心处理,其上清液含有大量抗体,可高达 ling/ lml,加 0.1%Na:N。分装贮一20℃备用。 (2)大量培养法即体外人工大量培养,一般把40ml生长旺盛的杂交瘤细胞培养液转移至含有1,00()m的培养瓶中,置滚动式的旋转轴的培养架上进行转瓶培养,经3—4天后培养液中的抗体含量达10—100微克/毫升,可从中提取其lgG。 四、条主力技术及单克隆抗体研究所回善本的仪器设备 1.无菌操作室和无菌培养室,2.CO。孵箱、3.倒置显微镜、4.生物显微镜、5.超净工作台、6.液氮贮藏罐及运输罐、7.ELISA (酶联免疫吸附测定)读数仪、8.普通冰箱及低温冰箱,9.消毒灭菌锅及电热干燥箱、10.酸度计、11.天平、12.恒温水浴、13.BALB/C,]’鼠饲养房及饲养笼等。如果条件允许可添置伽马计数器或液问计数器、萤光显微镜及萤光激活细胞分检仪。 五、国内研究动向 国内杂交瘤技术及单克隆抗体的研究工作以医学方面较为活跃,中国医学科学院所属的一些研究所和其它医学单位、中国科学院上海细胞生物学研究所等单位已获得了乙型肝炎、北京鸭红细胞等的杂交瘤细胞系及其单克隆抗体。 植物病毒和兽医方面还刚刚起步,预计今后在农业科学研究及生产中的应用将会有迅速的发展。杂交瘤技术和单克隆抗体及其在植物病害诊断与抗病育种中的应用@蔡少华$中国农业科学院蔬菜研究所

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