文献类型： 中文期刊

第一作者： 冯兰香

作者： 冯兰香

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期刊名称： 中国蔬菜

ISSN： 1000-6364

年卷期： 1986 年 1 卷 02 期

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摘要： 近十年来,菠菜病毒病在我国许多地区有所发展,逐渐成为生产上的重要问题。病株的症状最初都是心叶叶脉退绿(即明脉症),但以后的症状发展却不完全一样。有的病株叶片上出现许多黄色斑点,逐渐变成不规则形的深绿和浅绿相间的花叶,叶缘向下卷成波状,病株无明显矮化;有的病株除花叶外,叶片还变窄皱缩,有瘤状突起,植株严重矮化,心叶卷缩成球状,也有的病株叶片上有坏死斑,甚至心叶坏死,植株随之死亡。 关于菠菜病毒病的毒原,日本在六十年代报道有芜菁花叶病毒,蚕豆萎蔫病毒,甜菜花叶病毒和黄瓜花叶病毒,1983年又报道了菠菜温和病毒。欧、美一些国家则报道主要毒原是蚕豆萎蔫病毒。国内七十年代的一些书籍介绍了毒原有两类一黄瓜花叶病毒和芜菁花叶病毒,但无科研资料。后来有资料报道了蚕豆萎蔫病毒和甜菜花叶病毒。1984年笔者在西德对采自北京地区受病毒病侵染的菠菜植株和菠菜种子进行了毒原种类的鉴定。首先挑选不同症状类型的单株分别接种在蚕豆(yiciafaba)、 gr豆(Vignaungu7cujata)、甜菜(月eta vujgaris)、西风古(Amaranthus retraflexus)、老枪谷(A.caudatus)、菠菜(SPinacea of-eracea)、昆诺阿费(Chenopodium qui-noa)、心叶烟(Nicotiana glutinosa)、枯斑三生烟(N. tabacum cvs. SamsunNN)、白烟(N.tabacum White Burl-ey)、克利夫兰烟(N.clevelandii)、千B红(Gomphrena globosa)、黄瓜(Cucu-mis sativus)、矮牵牛(Petunia hghri-ja)和番杏(Tetragonia expansa)等鉴别寄主植物上,进行毒原种群的初步归类。在此基础上,用包括初步归类的毒原种类抗血清进行玻片微量凝聚法、琼脂免疫双扩散法及酶联免疫吸附法等血清学方法检测,对有血清学反应的毒原种类再进行病毒的单斑分离、纯化、繁殖、提纯、物理性状测定和电子显微镜观察病毒粒子形态等。菠菜种于的毒原鉴定是将种子播种在经高压蒸气消毒的土壤里,采集幼苗叶片,每株叶片至少20克,分株进行病毒的提纯和鉴定。结果表明获荣病毒病的毒原有四类一蚕豆萎着病毒、甜菜花叶病毒、黄瓜花叶病毒和菠菜温和病毒。以蚕豆荚蔫病毒最多,有83株,占鉴定总数114株的72.8%I甜菜花叶病毒次之,有21株,占鉴定总数的18.4%,其中有10株承与蚕豆萎蔫病毒复合侵染;黄瓜花叶病毒较少,有10株,占鉴定总数的8.8%,共中有5株也是与蚕豆美蔫病毒复合侵染。在鉴定的15粒菠菜种子中,有14粒种子长出的幼苗体内含有菠菜温和病毒粒子,种子带毒率为93%,菠菜温和病毒在我国还是第一次报道。下面重点介绍这四类病毒的物理性状和提纯方法。 一、 &豆赛蔫病毒 Broad Beau WIItVirus简称BBWV。病毒粒子球状,直径约25毫微米。稀释限点10-”一10-‘,钝化温度50一55t,体外存活期3—4天。可由机械方式和蚜虫传播,如桃蚜(MyZUS p6fsiCQ6)、菜豆蚜(APhis craccivora)、马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae)等,其中桃蚜是最有效的传每个体。 在蚕豆上表现系统花叶,茎部和顶端坏死,矮牵牛和克利夫兰烟也为系统花叶,在昆诺阿感、菠菜和千日红上既可产生局部坏死斑,又可出现系统花叶,鼓极易引起昆诺阿蓉植株顶部坏死。 该病毒提纯较困难,经多次摸索,用下面方法提纯,每公斤病叶可获得100毫克病毒。病毒接种在6周左右的昆诺阿菜叶片上,6一8天后采收病叶,以1:2(*/v)加入0.05mol磷酸钾缓冲液(pH7.5),内含linmol EDTA和0.15%流基醋酸钠,鼓匀浆。将吕.5%正丁醇慢慢倒人病汁液中,搅拌30分钟,置 4 C下过夜,然后5,000转/分离心40分钟,上清液在10CC下30,000转/分离心2小时,沉淀悬浮在0.0 4 mol磷酸缓冲液(PH7.0)中,即得到部分提纯的病毒。进一步提纯是通过10一40%(W/V)蔗糖密度梯度离心(用0.004mol磷酸缓冲液配制蔗糖梯度液),在20t下22,000转/分离心2.5/J’时。通过蠕动泵取出病毒带,经0.004mol磷酸缓冲液稀释后,在10C下30,000转/分离心2小时,最后将病毒悬浮在0.004mol磷酸缓冲液(pH7.0)中,即为提纯的病毒。 =、 ie＄＄ap病毒Beet Mosaic Virus简称BMV。病毒粒子丝状,长750urn左右,宽13urn左右。稀释限点5 x 10-’,钝化温度55一60C,在室温下体外存活期5—6天。可由机械方式传播,约有30种蚜虫为传毒介体,桃蚜和豆卫矛蚜(沁Phiz fabae)是田间最主要的传毒介体。 在菠菜接种叶上出现许多小黄斑,上位叶出现大片退绿斑,随着叶片老化,病斑逐渐坏死;在甜菜上是系统花叶,业有瘤状突起;在西风古、老枪谷上是局部病斑;在昆诺阿感、番杏和千日红上是局部退绿斑。 这类病毒的提纯一般不难,但不易获得产量高而纯的病毒,下面是比较新的提纯方公。清名接种在2一3片真叶的甜菜植株 上, 2— 3周后采收病叶,在0.5 inOI磷酸氢二钾缓冲液(pHS.5,内含0.02mol亚硫酸钠, 0.01mol铜试剂和 5 m mol EDTA)＄1:l氟里昂中匀浆(1克病叶加2毫升氟里昂),然后8,000转/分离心15分钟,取上清液30,000转/分离心 2— 8小时,沉淀悬浮在0.05mol的柠檬酸缓冲液中(pH 7.5),再经过1一2次每毫升含400毫克的氯化格平衡梯度离心,每次35,000转/分离心17,J’时,病毒带取出后再经30,000转/分离心 2— 8 ,j’时,最后沉淀悬浮在0.05mol柠檬酸缓冲液 (PH7.5)中即可。 三、黄风在叶病毒CucumberMosOOICVirSS简称CMV。病毒粒子球状,直径28一30urn,稀释限点10-‘,钝化温度60—70CC,室温下体外存活期3—4天。由机械方式和蚜虫传播,桃蚜和棉蚜(APhiS gOSSyPii)传毒率均很高。 在菠菜上表现系统花叶,重病株叶片畸形,植株矮化;在心叶烟、白烟、枯斑三生烟和黄瓜上均为系统花叶,叶片畸形;在蔓陀罗上除系统花叶外,有时有环斑。在昆诺阿感、蚕豆和处豆上是局部坏死斑。 该病毒的提纯方法很多,但都不十分理想。将病毒接种在枯班三生烟幼苗上,10一14天后及时采收病叶,一定要适时采收。除去叶片中肋冷冻过夜,提纯的全过程最好在 4 t下进行。病叶在0.sinol磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液(pH7.8,内含0.1%流基醋酸钠和 1%抗坏血酸)中匀浆, 1克病叶/ 2毫升缓冲液,经纱布过滤后,滤波中加入8%。聚乙M醇(分子量6,000),搅拌溶解后离心,沉淀在0.05mol柠檬酸(PH.5)缓冲浪中浸泡,放冰箱过夜。8,000转/分离心15分钟,上清液超速离心,30,000转/分8小时,范用0.01mol磷酸缓冲液(pH7.0)俺没沉淀较过夜。再将病毒悬浮液进行10—40%蔗糖密度梯度离心,30,000转/分离心2小时(用0.01mol磷酸缓冲浪PH7.0配制蔗糖梯Mst)取出病毒带经30,000转/分离心2小时,最后将病毒悬浮在0.oltuol磷酸缓冲液(PH7.0)中。 四、菠菜温和病毒Sp1ppCh TCCpprpt。Virus简称STV。病毒粒子球状,直径约30毫微米,具有双链RNA。该病毒不能通过机械方式和蚜虫传播,而由种子传播。种子带毒率很高,一般在90%以上。病株体内病毒浓度很低,通常不表现症状,未经浓缩的病汁液在电镜下观察不到病毒粒子。 该病毒的提纯很困难,下面的方法可获得一定量的病毒。当幼苗长至6—8片叶时,采收叶片,在0.lmol磷酸缓冲液(PH8.0,内含0.1%能基乙醇)和40%的氯价与正丁醇混合液(等体积混合)中匀浆,低速离心8,000转/分15分钟,上清波超速离心30、000转/分 8 ,J’时,沉淀悬浮在0.lmol磷酸缓冲浪中(PHS.0),全重复上述差速离心一次,再经10—40%(W/v)蔗糖密度梯度离』L’22,000转/分2.5,J’时(用0.lmol磷酸#冲被PHS.0配制蔗糖梯度波)。取出病毒带后用上述缓冲浪稀释,鼓超速离心30,000转/分2,l’时,沉淀悬浮在0.lmol磷酸缓冲液 (PHS.0)中,即为提纯的病毒。菠菜病毒病的毒原鉴定分离和提纯@冯兰香$中国农科院蔬菜所

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