猪β2肾上腺素能受体基因克隆及穿梭表达质粒的构建

文献类型： 中文期刊

第一作者： 王健

作者： 王健;王静;王淼;孔祥雅;祝凤彬;邵小雪

作者机构：

关键词： 猪;β_2肾上腺素能受体;基因克隆;序列分析;穿梭表达质粒

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2014 年 47 卷 18 期

页码： 3691-3699

收录情况： CSCD

摘要： 【目的】利用重组β_2肾上腺素能受体(β_2AR)检测β_2激动剂类药物,是弥补传统免疫学检测方法不足、实现该类违禁物多残留的快速检测手段。获得高纯度、高亲和力的重组受体是该技术的核心和难点。本文克隆猪β_2AR并构建其重组穿梭表达质粒,为筛选最适宜的受体表达系统和表达条件提供基础材料。【方法】克隆猪β_2AR并进行序列分析,完成重组穿梭表达质粒构建。首先采集新鲜猪肝组织,提取总RNA,根据GenBank已登录的猪β_2AR核苷酸序列(AF000134 ),设计1对引物并进行RT-PCR扩增。扩增产物切胶回收后与pMD-18T载体于4℃、T4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选后提取克隆质粒并对其作PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析。然后对所获得的基因及编码的氨基酸序列进行在线BLAST分析、系统进化树构建和疏水性分析。为了提高受体蛋白的表达量及受体配体间的亲和力,对该克隆基因作N端截短186个核苷酸改造；为使表达蛋白C端携带6×His标签,对克隆基因C端进行去除终止子改造。将改造后的克隆基因分别插入pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体,连接产物转入NovaBlue感受态细胞,经Amp抗性筛选,挑取单菌落提取质粒并进行鉴定。【结果】经分光光度计检测及琼脂糖凝胶电泳分析,所提猪肝细胞总RNA的纯度、浓度及完整性可满足后续试验要求。RT-PCR产物电泳结果显示,在1 200 bp左右出现1条特异性条带,与预期结果一致。克隆质粒pMD-18T-β_2AR经鉴定,证实为阳性重组质粒。测序结果显示,所得猪β_2AR基因cDNA序列全长1 257 bp,编码418个氨基酸。该序列已提交至GenBank,登录号为KF023571. 1, Compute pI/Mw在线软件预测该蛋白分子质量为46. 73 kD。与已发表的猪β_2AR(AF000134)相比,基因序列一致性为99.68%,4处发生碱基突变,编码的氨基酸序列一致性为99. 28%, 3处发生突变,且配体与受体结合位点处的氨基酸均得到正确克隆。在线BLAST分析表明,猪与其它物种的β_2AR及氨基酸序列一致性均在80%以上,具有较高的同源性。由系统进化树分析可知,所克隆的猪β_2AR与领西猯Pecan tajacu(JN 633666. 1 ）的亲性较近,与大仓鼠Tscherskia triton(AY683091. 1 ）和草原田鼠Microtus ochrogaster (XM 005356183.1 )的亲性较远。氨基酸疏水性分析表明,该受体蛋白N端以疏水性氨基酸为主,C端以亲水性氨基酸为主。经PCR和双酶切鉴定以及测序分析证明,成功构建重组穿梭表达质粒pTriEx-1. 1Hygro-β _2AR1-418和pTriEX-l.lHygro-β_2AR63-418。【结论】所获克隆基因与已发表猪β_2AR高度一致,且活性位点处的氨基酸均得到正确克隆。此外,pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体适宜用作大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统的启动子,是研究目标基因在不同表达系统表达效果的良好材料。本文所构建的穿梭表达质粒pTriEx-1. lHygro-β_2AR1-418和pTriEx-1. 1Hygro-β_2AR63-418均可用于以上3种表达系统中β_2AR蛋白的表达纯化研究。

分类号：

  • 相关文献

[1]猪β_2肾上腺素能受体基因克隆及穿梭表达质粒的构建. 王健,王静,王淼,孔祥雅,祝凤彬,邵小雪. 2014

[2]猪CD4基因编码区及其剪接体克隆与表达分析. 许金根,张勤,王立克,任曼,李升和,王重龙. 2016

[3]猪ADAR1基因cDNA全长克隆、序列信息及组织表达分析. 张跃博,欧阳峰正,王立刚,侯欣华,刘欣,颜华,张龙超,王立贤. 2019

[4]猪血小板源生长因子受体α基因(PDGFRα)cDNA克隆与表达分析. 滕菲. 2015

[5]猪Gli1基因的克隆、表达谱分析及脂肪组织特异性表达载体的构建. 林佳丽,沈良才,潘登科,张瑾. 2012

[6]猪围脂滴蛋白基因cDNA部分片段的克隆及序列分析. 杨红文,王春凤,粟朝芝,韦毕芬,李洪曙. 2010

[7]猪Lipin基因克隆及其组织分布的研究. 鲁维飞,王静,李宏基,郭豫杰,李奎,杨国宇. 2013

[8]一株猪源1型呼肠孤病毒的分离及鉴定. 何小明,姚火春,张洪彪,蔺涛,袁世山,龙进学,丁铲. 2012

[9]猪PKM2基因的序列分析与组织表达及亚细胞定位. 赵为民,涂枫,方晓敏,王学敏,付言峰,李碧侠,周李生,任守文. 2019

[10]上海地区猪戊型肝炎病毒部分序列的克隆与分析. 宁海强,李震,于瑞嵩,张佩华,牛钟相. 2007

[11]部分地区猪传染性胃肠炎病毒株ORF7基因的序列分析. 满朝来,于晓龙. 2011

[12]猪NR4A1基因的克隆、序列分析及表达模式研究. 刘林清,李凤娥,熊远著,邓昌彦. 2016

[13]猪MBF1基因的克隆与序列分析. 武华玉,程碧军,乔木,黄京书,刘贵生,彭先文,李良华,吴俊静,梅书棋. 2015

[14]一株猪源1型呼肠孤病毒的分离及鉴定. 何小明,姚火春,张洪彪,蔺涛,袁世山,龙进学,丁铲. 2013

[15]猪PGAM2基因的克隆、序列特征及表达分析. 伍晓雄,唐中林,李勇,杨述林,储明星,马月辉,李奎. 2008

[16]猪IRGC基因的克隆与序列分析. 武华玉,乔木,李良华,郭万正,彭先文,孙华,黄京书,梅书棋. 2010

[17]H1N1猪流感广东株血凝素基因的克隆与序列分析. 胡永浩,姚学萍,李海燕,赵有淑,杨焕良,陈化兰. 2005

[18]猪乙脑病毒BHK-21细胞传代株BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60的全基因组序列分析. 滕蔓,胡博,冯丽丽,樊剑鸣,郅玉宝,李秀杰,邓瑞广,罗俊. 2016

[19]部分地区传染性胃肠炎病毒株S基因的序列分析. 满朝来,于晓龙. 2011

[20]猪繁殖与呼吸综合征病毒FJ04A株的分离及其结构蛋白基因特性分析. 周伦江,王隆柏,魏宏,陈少莺,车勇良,陈仕龙,庄向生. 2006

作者其他论文 更多>>

微信小程序