细粒棘球绦虫MDH基因的克隆表达结构功能预测及蛋白定位

文献类型： 中文期刊

第一作者： 普娜

作者： 普娜;赵文卿;张玉霞;陈旭珂;张艳艳;孙艳;薄新文;王正荣

作者机构：

关键词： 细粒棘球绦虫;苹果酸脱氢酶;生物信息学;原核表达;间接免疫荧光

期刊名称： 中国兽医科学

ISSN： 1673-4696

年卷期： 2024 年 54 卷 003 期

页码： 393-402

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为了探究苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)基因在细粒棘球绦虫(Echinococcus granu-losus)生长发育中的生物学功能并初步评价MDH作为疫苗候选抗原的潜力,从NCBI GenBank数据库中获得EgMDH基因序列,设计特异性引物,以细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA为模板,用PCR扩增MDH基因全长序列;采用生物信息学软件对MDH蛋白的理化性质、结构特点等进行分析;构建重组质粒pET28a-MDH并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,随后纯化、复性蛋白,并通过Western-blot对蛋白进行抗原性分析;利用间接免疫荧光试验检测原头蚴中目的蛋白的定位;应用实时荧光定量PCR分析EgMDH基因mRNA在原头蚴及成虫中的相对转录水平.生物信息学分析结果显示,EgMDH基因长999 bp,编码332个氨基酸,蛋白分子式为C1639H2599N445O475S16,相对分子质量为36651.32,理论等电点为8.11,且编码蛋白没有信号肽和跨膜区,含有40个磷酸化位点,3个N连接型糖基化位点,9个优势B细胞抗原表位.二级结构由α-螺旋(46.69%)、无规则卷曲(31.93%)、延伸链结构(16.87%)和β-转角(4.52%)构成.克隆的基因长975 bp,预测分子质量为35.7 ku;Western-blotting显示,重组蛋白可以被抗His标签的家兔多克隆抗体和原头蚴可溶性全蛋白小鼠多克隆抗体识别;间接免疫荧光试验显示,EgMDH蛋白定位在原头蚴的囊壁;实时荧光定量PCR显示,EgMDH基因在成虫及原头蚴中均有表达,且原头蚴阶段的转录水平显著高于成虫(P<0.05).本研究结果初步表明EgMDH具有作为疫苗候选抗原的潜力,以期为后续细粒棘球绦虫疫苗研发提供候选抗原;同时也为后续细粒棘球绦虫MDH基因的深入研究奠定了基础.

分类号： S852.734

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