文献类型： 中文期刊

第一作者： 洪勇

作者： 洪勇;何永睿;梁丽;陈善春;张进仁

作者机构：

期刊名称： 中国南方果树

ISSN： 1007-1431

年卷期： 2000 年 29 卷 06 期

页码： 13-14

收录情况： 北大核心

摘要： 在柑桔胚状体高频发生、三倍体幼胚培养、败育胚的抢救和原生质体培养及融合研究过程中 ,常常伴随着畸形胚的大量形成 ,如多胚、多子叶、次级胚、幼根愈伤化肥大等 ,难以萌发成苗 ,实际上降低了植株再生频率 ,从而影响了柑桔的生物技术育种进程。本研究的目的是通过改变培养方式和培养条件探讨畸形胚成苗能力 ,这对进一步提高植株再生频率具有一定的指导意义。1　材料与方法1 1　畸形胚的诱导从花后 6～ 7周龄的新会橙、柑、葡萄柚的幼果中挑出幼胚珠接种于愈伤组织诱导培养基 (ＭＴ +ＢＡ 10ｍｇ 1)上 ,2 0天后长出白色的愈伤组织 ,经继代筛选获得驯化的胚性愈伤组织。转入胚状体诱导培养基 (ＭＴ +ＢＡ 1ｍｇ 1+ＣＨ 50 0ｍｇ 1) ,很快产生大量的球形胚状体 ,平均每克愈伤组织 (鲜重 )形成的胚状体数高达 671个 ,转入成苗培养基 (ＭＴ +ＧＡ 2ｍｇ 1)上促进萌发 ,约 2 6%的胚状体不能萌发 ,大多发育畸形。1 2　畸形胚的培养畸形胚接种在ＭＴ、ＭＳ、Ｎ6、Ｂ5培养基上 ,分别附加不同浓度的ＢＡ、ＫＴ、ＩＡＡ、ＮＡＡ、ＡＢＡ、ＭＥ、ＣＨ等生长调节剂和生理活性物质及其组合 ,用维生素Ｃ处理 ,以蔗糖、乳糖和甘油作碳源进行不同的处理。培养温度为 2 8± 1℃ ,每天光照 12小时 ,光强 2 0 0 0ｌｘ。2　结果与分析2 1　适宜培养基的选择为了解基本培养基对畸形胚发育的影响 ,用ＭＴ、ＭＳ、Ｎ6和Ｂ54种基本培养基进行试验 ,2 0天后调查结果表明 :畸形胚在ＭＴ和ＭＳ中继续发育 ,不断地从胚状体基部和子叶上产生新的子叶和次级胚 ,不同的是在ＭＳ中有少数子叶出现轻微白化现象 ,其继代增殖的效果不如ＭＴ ;在Ｎ6和Ｂ5中则生长缓慢 ,白化现象严重 ,明显抑制了畸形胚的发育。在 4种培养基中连续继代两次都没有观察到不定芽的产生或直接萌发成苗的现象 ,说明基本培养基无法直接诱导畸形胚成苗 ,只能使胚状体畸形增殖 ,但培养基的选择可能会影响畸形胚成苗的效果。由此可见 ,相对于其他 3种培养基 ,ＭＴ培养基对畸形胚的发育更适合。2 2　植物生长调节剂对畸形胚成苗的影响在以往实验中 ,多用ＭＴ +ＢＡ 0 5ｍｇ 1+ＫＴ0 5ｍｇ 1+ＮＡＡ 0 1ｍｇ 1从畸形胚中诱导不定芽。从本实验结果中看出 (表 1) ,用ＩＡＡ代替ＮＡＡ后 ,虽然平均芽数降低 ,但获得的有效不定芽数要高 ,取得更好的诱导效果。表 1还列出了畸形胚在ＢＡ和ＩＡＡ的几种不同浓度组合中继代两次后的诱导表现 ,同许多试验结果一样 ,生长素和细胞分裂素配合能有效地调控细胞状态 ,通过调整两种生长调节剂的适合比例可以刺激不定芽的产生 ,其中以ＢＡ1ｍｇ 1和ＩＡＡ 0 2 5ｍｇ 1组合的效果最好 ,当ＢＡ浓度高于 2ｍｇ 1时 ,更多的是诱导出愈伤组织 ;而随着ＩＡＡ浓度的提高 ,不定芽诱导频率和平均芽数显著降低 ,高于1ｍｇ 1时几乎难以诱导出芽。试验在 3、4、5、6号培养基中都获得了较高的诱导频率 ,当ＢＡ和ＩＡＡ的浓度比例在 4∶1时效果最好 ,在 4号培养基中观察到少数畸形胚直接成苗的现象 ,表现了畸形胚具有直接萌发成苗的能力。试验表明 ,0 5ｍｇ 1ＡＢＡ能够促进畸形胚诱导不定芽 ,加入到 3、6号培养基中培养 60天后其不定芽诱导频率和平均芽数分别提高到 4 7 5%、4 6 8%和3 92、3 80个 ,但在 5号培养基中却并不明显。2 3　碳源种类及浓度对畸形胚成苗的影响试验采用了不同浓度的蔗糖、乳糖和甘油作惟一碳源 ,结果表明 :相应浓度的乳糖诱导不定芽的频率要高于蔗糖 ,浓度为 2 0ｇ 1时两者的诱导率都很低。在一定范围内 ,随着浓度的增加其不定芽诱导频率和平均芽数也相应提高。较高的浓度 ( 60ｇ 1)有利于诱导较多的从芽 ,但是诱导的芽较纤细 ,少数芽和叶片出现畸形生长。只有在 4 0ｇ 1时不定芽粗壮且形态正常。而甘油不利于不定芽的诱导 ,畸形胚在加入甘油的培养基上生长基本停滞。表 1　植物生长调节剂对新会橙畸形胚成苗的影响 培养基编号植物生长调节剂 (ｍｇ 1)ＢＡＫＴＩＡＡＮＡＡ不定芽再生频率 (% )平均不定芽数 (个 ) 备　注15 0 0 0 10 2 7 1 2 0在基部和子叶边缘产生大量白色松软的愈伤组织2 2 0 0 0 10 9 5 1 45部分畸形胚表面出现黄色愈伤组织3 1 0 0 0 10 39 7 3 40———40 5 0 0 10 2 3 5 3 10少数畸形胚直接萌发成苗5 1 0 0 0 2 5 0 5 1 0 6 5 0不定芽较粗 ,在 0 2～ 1 2ｃｍ之间6 1 0 0 0 0 34 0 3 2 9———71 0 0 1 0 0 4 5 1 15产生大量次级胚和新的子叶80 5 0 5 0 10 40 5 2 30不定芽较粗 ,高约 1～ 1 5ｃｍ90 5 0 5 0 0 134 5 4 0 0不定芽较细 ,在 0 2～ 1 5ｃｍ　　注 : 基本培养基为ＭＴ ,蔗糖浓度为 40ｇ ｌ,继代频率 30天 ; 平均不定芽数 =总芽数 诱导出芽的畸形胚数。2 4　不同附加物对畸形胚成苗的影响在 3、5号培养基中加 50 0ｍｇ 1的ＣＨ和ＭＥ ,对新会橙畸形胚培养继代两次 ( 60 )天后 ,成苗率分别为 4 0 0 %和 51 3% ,比对照略有提高 ,不定芽生长状况要好于对照。而加入到ＭＴ基本培养基中只出现畸形胚自身生长 ,并没有不定芽的生成。表明上述生理活性物质对畸形胚成苗的促进作用并不明显 ,不是畸形胚成苗的决定因素 ,只在一定程度上对不定芽后期生长有利。在培养基中加入 0 2 %维生素Ｃ后 ,畸形胚逐渐失绿 ,变成灰白色 ,在接触培养基的部分有的出现黑色 ,把这种胚状体转到不含维生素Ｃ的 5号培养基上 ,仍然无法恢复生长 ,表明维生素Ｃ对畸形胚发育有着严重的毒害作用。2 5　继代频率对畸形胚成苗的影响继代频率对柑桔畸形胚的影响极大 ,试验在 10～ 60天 代的频率范围内进行 ,当低于 2 0天 代时 ,从畸形胚上不断地产生新的子叶胚和次级胚 ,没有产生不定芽 ;随着继代频率的提高 ,不定芽诱导频率显著提高 ,在 30天 代时达到最高 ,当高于 30天 代时 ,由于培养基中的营养物质大量消耗 ,激素水平降低 ,外植体分泌的有害物质增多 ,不定芽诱导能力降低。2 6　不同形态的畸形胚对成苗的影响柑桔畸形胚最常见的有多胚、多子叶、次级胚和膨大球形胚 ,选择以上 4种形态的畸形胚培养在 5号培养基上 ,继代两次后 ,比较不同形态的畸形胚的成苗能力。结果表明 ,膨大球形胚的成苗能力最高 ,平均芽诱导频率在 50 %以上 ,但胚的大小影响成苗率 ,直径在 0 5ｃｍ以下的基本无法成苗 ,大于 0 5ｃｍ的随着直径的增大其成苗率不断提高 ;把次级胚保留在外植体上培养 ,只能从外植体上诱导出不定芽 ;将次级胚从外植体上切下培养 ,次级胚逐渐增大 ,但成苗困难 ,因此要想从次级胚上直接得到不定芽是很困难的 ;将子叶从多子叶畸形胚上分离培养有助于不定芽的诱导 ,其诱导频率在 35%左右 ,其中颜色呈深绿色的诱导频率超过 4 5% ;多胚的诱导能力比多子叶低 ,约为 2 9% ,对于较大的多胚直接分胚培养 ,诱导不定芽较为容易。柑桔畸形胚再生植株的研究@洪勇$中国农业科学院柑桔研究所!重庆400712 @何永睿$中国农业科学院柑桔研究所!重庆400712 @梁丽$西南农业大学基础科技学院 @陈善春$中国农业科学院柑桔研究所!重庆400712 @张进仁$中国农业科学院柑桔研究所!重庆400712

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