弓形虫GRA1蛋白表达及间接ELISA检测方法的建立

文献类型： 中文期刊

第一作者： 张翩

作者： 张翩;陈晶;张晓晓;麦小鹏;唐科;向华;王刚;罗胜军;马惠海;袁子国;王晓虎

作者机构：

关键词： 猪;弓形虫;GRA1;原核表达;间接ELISA

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2025 年 52 卷 007 期

页码： 3308-3320

收录情况： 北大核心

摘要： 【目的】通过原核系统表达弓形虫GRA1蛋白，并建立其抗体间接ELISA（iELISA）检测方法，为猪弓形虫抗体检测提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-GRA1,利用大肠杆菌表达系统表达GRA1蛋白，并用His镍柱进行GRA1蛋白纯化，经Western blotting鉴定其免疫原性。以纯化的GRA1蛋白作为抗原包被于固相载体，并用棋盘法确定抗原最佳包被浓度和待测血清稀释度。在此基础上，优化抗原包被条件、封闭条件、待测血清稀释度和酶标二抗稀释度。通过测定阴性血清D450 nm值确定所建立方法的临界值，并进行特异性、敏感性和重复性试验，同时测定该方法与改良凝集试验（MAT）对实际样品检测的符合率。【结果】SDS-PAGE结果显示，GRA1蛋白以可溶性形式表达，蛋白分子质量约为25 ku。Western blotting显示GRA1蛋白与猪弓形虫阳性血清发生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为：抗原最佳包被浓度为5μg/mL,血清稀释度为1∶100,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,最佳封闭条件为5%脱脂奶粉37℃作用2 h,待检血清作用时间为60 min,酶标二抗稀释度为1∶20 000,TMB作用时间为15 min。该检测方法的临界值为0.277。该方法敏感性良好，血清按1∶6 400稀释后仍可检测到阳性；批内和批间重复性变异系数均<10%,重复性好；与猪带绦虫、旋毛虫、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均无交叉反应，具有良好的特异性。利用该方法和MAT方法对100份临床猪血清进行检测，总符合率为94.0%。【结论】本研究建立了一种快速有效的检测猪弓形虫抗体的间接ELISA方法，有助于猪感染弓形虫病的诊断和预防。

分类号： S852.72

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