茶尺蠖水通道蛋白EoAQP1的cDNA克隆、多克隆抗体制备及亚细胞定位

文献类型： 中文期刊

第一作者： 李良德

作者： 李良德;王定锋;刘丰静;李慧玲;张辉;吴光远

作者机构：

关键词： 茶尺蠖;水通道蛋白;克隆;生物信息学;表达模式;亚细胞定位;多克隆抗体

期刊名称： 昆虫学报

ISSN： 0454-6296

年卷期： 2016 年 59 卷 04 期

页码： 382-391

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一种广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中的跨膜转运蛋白,它在细胞水分运输、离子选择透过性和渗透压平衡等过程中发挥着重要的作用。本研究旨在分析茶尺蠖Ectropis obliqua Prout水通道蛋白AQP1的基因特性,在制备多克隆抗体的基础上了解其亚细胞定位分布。【方法】采用同源克隆方法并结合RACE技术克隆茶尺蠖AQP1的基因全长,通过生物信息学网站和软件分析茶尺蠖AQP1的生物学信息;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测茶尺蠖AQP1在不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的相对表达量;通过原核表达、镍柱纯化并免疫新西兰兔制备了茶尺蠖AQP1的多克隆抗体;通过荧光显微镜观测了茶尺蠖AQP1在黑腹果蝇Drosophila melanogaster胚胎细胞S2中的定位分布,并利用多克隆抗体进行了Western blot验证。【结果】克隆并鉴定了茶尺蠖AQP1全长,将其命名为Eo AQP1(Gen Bank登录号:KT819587),Eo AQP1 c DNA全长1 826 bp,含有780 bp开放阅读框,编码259个氨基酸。系统进化树和氨基酸序列同源性比对表明,Eo AQP1在鳞翅目昆虫中高度保守。跨膜结构和水分渗透模拟表明,Eo AQP1具有经典的水分渗透模型。qRT-PCR结果表明,Eo AQP1在不同发育时期和6龄幼虫不同组织中均有表达且差异显著。亚细胞定位结果表明,Eo AQP1以圆形颗粒状成群聚集于细胞膜周边,而在细胞膜、核膜和细胞质等处均不表达。多克隆抗体Western blot检测结果表明,Eo AQP1多克隆抗体特异性较好,可用于后续相关实验。【结论】获得了Eo AQP1的c DNA序列,明确了Eo AQP1的生物学特征,阐明了Eo AQP1的时空表达特性,成功制备了Eo AQP1多克隆抗体,初步了解了Eo AQP1的亚细胞定位,为进一步研究Eo AQP1的水分渗透机理奠定了分子基础。

分类号： S435.711

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