芸薹根肿菌活细胞PMAxx-qPCR快速定量检测方法的建立与应用

文献类型： 中文期刊

第一作者： 李晓菁

作者： 李晓菁;张思雨;刘迪;袁晓伟;李兴盛;石延霞;谢学文;李磊;范腾飞;李宝聚;柴阿丽

作者机构：

关键词： 芸薹根肿菌;根肿病;改良叠氮溴化丙锭;实时荧光定量PCR;活性孢子

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2022 年 55 卷 010 期

页码： 1938-1948

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的十字花科根肿病是一种世界性土传病害,病原菌长期存在于土壤中,对十字花科作物造成严重威胁.改良叠氮溴化丙锭(propidium monoazide xx,PMAxx)可选择性地穿透受损的死细胞膜,并抑制死细胞DNA的实时荧光定量PCR(qPCR)扩增.本文将PMAxx与qPCR技术相结合,建立一种快速检测芸薹根肿菌活菌的方法,为根肿病的早期诊断及制定科学的防控措施提供依据.[方法]配置浓度分别为0、5、10、20、40、60μmol·L-1的叠氮溴化丙锭PMA和改良叠氮溴化丙锭PMAxx,比较两种核酸染料对芸薹根肿菌死细胞DNA扩增的抑制效果,确定最佳核酸染料及工作浓度;设置光照时间分别为0、2、5、10、15和20 min,进行最佳光照时间的优化,建立芸薹根肿菌活细胞PMAxx-qPCR快速检测体系.设置芸薹根肿菌活孢子百分比为0、0.01%、0.1%、1%、10%、25%、50%、75%和100%的混合体系,验证PMAxx-qPCR体系的准确性,并应用于田间土壤样本中芸薹根肿菌活孢子的定量检测.[结果]PMAxx对芸薹根肿菌死细胞DNA的扩增抑制效果更好,当芸薹根肿菌浓度为1×108个孢子/mL,PMAxx预处理的最适终浓度为4μmol·L-1,最佳光照时间为10 min时,可有效地抑制死孢子DNA的扩增,仅以有活力孢子DNA为靶标选择性地扩增.利用PMAxx-qPCR技术检测已知不同活孢子比例的菌悬液样品,各样品实测孢子存活率和理论存活率之间呈正相关(R2=0.992).对田间采集的25份土壤样本,采用PMAxx-qPCR方法检测到11份样本中携带芸薹根肿菌,活细胞DNA浓度为32.35-6.97×103fg·g-1.[结论]建立了基于PMAxx-qPCR的芸薹根肿菌活细胞定量检测技术,该技术具有快速、准确、灵敏的特点,解决了 qPCR不能仅对活体病原菌进行准确鉴别和定量分析的问题,为制定有效的根肿病防控策略提供了依据.

分类号： S432.4

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