文献类型： 中文期刊

第一作者： 冯兰香

作者： 冯兰香;刘佳;蔡少华

作者机构：

期刊名称： 中国蔬菜

ISSN： 1000-6364

年卷期： 1986 年 1 卷 04 期

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摘要： 芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Vi-rus简称TuMV)广泛分布于世界各地,是十字花科作物上的重要病毒,常造成严重为害。在大白菜、甘蓝及油用油菜的毒原种类鉴定,TuMV株系鉴定和抗病毒育种中,经常碰到如何提纯到高纯度、高产量的芜菁花叶病毒的问题。 TuMV是马铃薯Y病毒组(Polyvirusgroup)的成员,其提纯方法不少。由于这个组的病毒在提纯过程中易发生病毒粒子集聚现象,因此极大地影响了提纯病毒的产量和纯度,提纯效果很不稳定。近几年来,我们在前人研究的基础上,着重对以下几个问题进行了探索,取得了一些经验,并在工作中得到应用。 1.关于繁殖寄生的问题 可供繁殖TttMV的寄主很多,如Bras-s。ca PerviriBis、 B.Pekinensis(中国大白菜)、 B.raPa(芜著)、 Petuniahybrida(矮牵牛)、 Nicoffana gi。tinosa(。L’叶烟)和N.cleoelandii(克利夫兰烟)等,而且均有提纯成功的先例。但心叶烟和克利夫兰烟生长缓慢、叶片小,短期内不易获得大量的病叶,矮牵牛也基本如此。大白菜、油菜和芜育是最佳的供提纯用的繁殖寄主,栽培容易,生长快,叶片大,症状明显,含毒量较高,特别是大白菜和油菜来源极为丰富。 为了获得较多的病叶,接种时的苗龄不宜太小,一般4—5叶期为宜。繁殖的温度不宜过低,25—28t为好,接种后10夫开始发病,20天左右病毒含量达到高峰,油菜时间稍长需25—30天,但植株体内病毒含量的变化不像黄瓜花叶病毒那样剧烈,因而,接种后可多次采收,如油菜,接种后2个月仍可采收病叶。 提纯前,最好将病叶在一20℃下冰冻3一4天,这样病叶容易被粉碎,也有利于抑制寄主体内某些氧化酶的活性,并不降低病毒产量和侵染性。 2.关于提取病毒的缓冲液问题 用于研磨病叶的缓冲液的种类,浓度及PH值对提纯效果影响很大,不同病毒所需的缓冲液在离子性质、离子浓度以及PH值方面都不尽相同。正确使用适当的缓冲波能提高病毒收取率,并使病毒保持稳定、避免凝聚和钝化。 前人用0.05—0.smol磷酸缓冲液(PH7.5)和0.05mol—0.smol硼酸缓冲液(pH7.8—8.0)都曾成功地提纯了芜青花叶病毒。而在我们的试验中,磷酸缓冲液的效果优于硼酸缓冲液,而且高浓度的效果又优于低浓度,由于高浓度的磷酸缓冲液有防止病毒聚集的作用,所以我们常用的是0.smol磷酸钾缓冲液(PH7.5,用磷酸氢M钾和磷酸二氢钾配制)。 为了防止病毒被细胞破碎后释放出的许多酶特别是氧化酶所氧化和抑制病毒凝聚,往往在缓冲液中加人一些还原剂或酶的抑制剂及赘合剂,如HaME*TA(二乙胺四乙酸M钠), Na—DIECA(M乙基硫代甲酸钠),腺素、Thioglycolic acid(或基醋酸)、2一流基乙醇和抗坏血酸等。据我们的试验,加人0.1% &基醋酸和0. 01molN。一EDTA的效果明显优于其它附加物质,但流 g醋酸国内不易买到。 0.01mol Na一DIECA,0.02mol,Na。SO。等效果尚可,且容易购买。 3.关于粗提取液的澄清问题 澄清粗提取液就是将大部分植物蛋白从粗提液中沉淀下来,这主要依靠多种有机溶剂的作用,常用的有机溶剂有氯仿,正了醇等,虽然在TU*V粗提液中加入8%正丁醇或1/2体积(V/V)氯仿可起到澄清的作用,但往往显著地降低了病毒的活性。曾有人加人1/5体积的奥土,澄清效果非常好,可使病毒严重地被钝化。 我们用氟利昂(Freon,1,1,2—三氯三氟甲烷)澄清粗提液效果很不错,既可以除去寄主蛋白又不太影响病毒活性。一般用法是当病叶在组织捣碎机里被捣碎后,加人与病叶同量 (/V)的氟利昂并匀浆1分钟,低速高心后的上清液就是粗提液。 在提纯TuMV’的过程中,加人1%TritonX—100(烷基聚氯化乙醇)能消解叶绿体,其解体物原则在病毒高速离心时残存于上清。液中,同时也可防止病毒粒子的聚合。 4.关于病毒的沉淀间题 为了浓缩和提纯病毒,需要把病毒从澄清液中沉淀出来,这多半是用超速离心法沉淀病毒。从六十年代起, PEG开始用于沉淀马铃薯Y病毒组的病毒,如4%或6%P,EG(分子量6000)或 4%PEG(分子量8000)沉淀TUMV效果不错,但一般是一次PEG沉淀。我们感到两次PEG沉淀可减少超速离心的次数,但是也带来了一个问题,PEG使病毒粒子与寄主组织之间更容易聚集,病毒丢失现象严重。为了克服这一缺点,在澄清液中除加入 1%TritonX—100外,同时还应加人0.lmol NaCI。 5.关于悬浮病毒的缓冲液问题 曾有人 ffio.02—0.05mol硼酸缓冲液 (pH7.5)重新悬浮T-uMy沉淀,但随着对马铃薯Y病毒组病毒的深入研究,逐渐认为用高浓度的磷酸缓冲液最好,在0.smol磷酸钾缓冲液(pH7.幻中加入0.01molMgCI。或om.srnolbe素,可提高阻止病毒聚集的效果,其原因可能是Mg“”和购素打断了病毒粒子的疏水键。加入0.05mo1Na-EDTA的效果不明显,值得提出的是,如果在低浓度(0.05mol)磷酸缓冲液中加入0.smolde素反而会降低病毒的活性。 综上所述,我们提出以下两种提纯方法供参考。 用上述方法提纯的样品,多次经电镜和紫外光谱检查,其纯度和产量均较好。电镜观察为均一的TU*V长线条状粒子。紫外吸收峰在258—260毫微米,光密度A260/280为1.20—1.26,每公斤病叶可获得约50毫克的病毒,且效果比较稳定。芜菁花叶病毒提纯中的几个问题@冯兰香$中国农科院蔬菜研究所 @刘佳$中国农科院蔬菜研究所 @蔡少华$中国农科院蔬菜研究所

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