基于牛分枝杆菌融合蛋白ESAT6-CFP10-TB27.4间接ELISA检测方法的建立

文献类型： 中文期刊

第一作者： 姜美奇

作者： 姜美奇;赵文娟;许淑芸;魏京京;黎雪勤;徐雪可;周霞;吴桐忠;王莉莉;韩猛立;张星星;张倩;钟发钢;黄新

作者机构：

关键词： 牛分枝杆菌;ESAT6-CFP10-TB27.4融合蛋白;原核表达;间接ELISA

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2025 年 47 卷 005 期

页码： 480-486,515

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为建立检测牛分枝杆菌(MB)抗体的间接ELISA方法,本研究选取MB ESAT6、CFP10和TB27.4基因,通过柔性linker(GGGGS)连接,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-EC-27.4,经双酶切及测序鉴定正确后,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),并在不同温度和时间下经IPTG诱导表达并超声破碎.采用镍亲和层析方法纯化重组EC-27.4蛋白(rEC-27.4)后,通过SDS-PAGE检测rEC-27.4的表达及纯化效果,采用western blot检测其反应原性.SDS-PAGE结果显示,当IPTG浓度为0.3 mmol/L,温度为16℃时,诱导rEC-27.4的表达量最高且其以可溶性形式表达,且纯化后在75 ku处出现单一目的条带.Western blot结果显示在75 ku处出现特异性条带.经BCA试剂盒测定rEC-27.4的浓度为0.852 mg/mL.以纯化的该重组蛋白作为包被抗原,采用棋盘法优化各反应条件,初步建立检测MB抗体的间接ELISA方法.采用优化后的间接ELISA方法分别检测MB阳性和阴性血清以及沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副结核分枝杆菌、结核分枝杆菌、布鲁氏菌和牛病毒性腹泻病毒等阳性牛血清,评估该方法的特异性;将MB阳性血清2倍倍比稀释(1:50~1:6 400)后,采用本研究建立的间接ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;以同批次和不同批次表达的rEC-TB27.4分别包被ELISA板,采用优化的间接ELISA方法检测5份MB阳性血清和3份阴性血清,评估该方法的重复性.结果显示,该方法仅能检测到MB阳性血清,其他相关细菌及病毒阳性血清均为阴性结果;牛分枝杆菌阳性血清1:400稀释时仍为阳性结果;该方法对8份血清的批内、批间重复性试验的变异系数均小于7%.采用建立的间接ELISA方法检测377份临床牛血清样品,并同时采用动物结核分枝杆菌夹心ELISA抗体检测试剂盒及PPDB皮肤试验(TST)和BTB IFN-γ释放试验(IGRA)检测,结果显示,该间接ELISA方法的阳性检测率为6.90%(26/377),阴性样品数为351份;夹心ELISA试剂盒的阳性检测率为7.43%(28/377),阴性样品数为349份;TST和IGRA的阳性检测率均为52.52%(198/377),阴性样品数均为179份.本研究建立的间接ELISA与夹心ELISA抗体检测试剂盒的阳性和阴性符合率分别为53.6%和96.8%;与TST和IGRA的阳性和阴性符合率均为11.1%和97.8%.本研究基于MB rEC-27.4建立的间接ELISA抗体检测方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,在MB所致牛结核的早期检测中有一定的优势,为牛结核的检测和早期诊断提供了新的技术手段.

分类号： S852.61

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