花鲈虹彩病毒交叉引物恒温扩增检测方法的建立

文献类型： 中文期刊

第一作者： 马艳平

作者： 马艳平;覃宝田;梁曦;王刚;郝乐;周东来;刘振兴

作者机构：

关键词： 花鲈虹彩病毒;交叉引物恒温扩增;特异性;灵敏度;核酸试纸条;可视化

期刊名称： 广东农业科学

ISSN： 1004-874X

年卷期： 2024 年 003 期

页码： 148-156

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】花鲈虹彩病毒（Lateolabrax maculatus iridovirus,LMIV）严重威胁花鲈养殖业安全，无特效防控药物，早期诊断在LMIV防控中发挥极其重要的作用。建立一种简便、快捷、准确的现场快速诊断方法，可为LMIV的基层诊断提供技术支撑。【方法】利用交叉引物恒温扩增技术（Cross priming amplification,CPA），针对LMIV ATPase基因高保守区设计1套单交叉引物。以构建的ATPase重组质粒作为阳性模板，对反应体系中的引物浓度比，Bst DNA聚合酶、Betaine、MgSO4、dNTP浓度，以及反应温度和反应时间进行优化；结合一次性核酸试纸条，建立可视化检测LMIV-CPA的方法。【结果】最优引物浓度比组合为交叉引物CPF1.0μmol/L，引物F3和B3均为0.4μmol/L，探针引物B1（FAM）和B2（Biotin）均为0.8μmol/L;MgSO4浓度为6 mmol/L、Betaine浓度为0.4 mol/L、dNTP浓度为0.6 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为0.256 U/μL；最佳反应温度为62℃，最佳反应时间为45 min。扩增产物经凝胶电泳检测呈梯形条带，带有探针的反应产物采用一次性核酸试纸条检测装置进行检测，在3～5 min内即可通过是否出现特征性条带而使反应结果可视化。该方法可特异性地检测出LMIV，不与其他水生常见病毒和常见细菌发生交叉反应。使用LMIV-CPA方法和常规PCR方法共同检测156份临床样品，LMIV-CPA的阳性检出率为93.30%，常规PCR方法的阳性检出率为85.83%；在比较二者的灵敏度差异时，LMIV-CPA的检测限为102 copies/μL，灵敏度为常规PCR的10倍，综合结果显示LMIV-CPA优于PCR。【结论】LMIV-CPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员，可应用于LMIV的现场快速检测，为花鲈LMIV的准确快速诊断和有效防控提供技术支撑。

分类号： S943

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