宿主分子Tyro3对猪瘟病毒复制的影响及其与E2蛋白相互作用的研究

文献类型： 中文期刊

第一作者： 屈亮

作者： 屈亮;郑光来;于少雄;仇华吉;李素

作者机构：

关键词： Tyro3;TAM受体;猪瘟病毒

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2021 年 011 期

页码： 1184-1191

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 本研究室前期研究发现受体酪氨酸激酶家族（TAM）成员Mertk为猪瘟病毒（CSFV）的侵入因子。为研究TAM受体家族另外两个成员Tyro3及Axl对CSFV复制的影响,本研究设计并合成了针对Tyro3、Mertk、Axl的siRNA（siTyro3、siMertk、siAxl）和一条无关siRNA（siNC）,将这3种siRNA分别转染PK-15细胞,24 h后以MOI 0.01感染CSFV-SM,48 h后经荧光定量PCR检测各分子的表达以及CSFV基因拷贝数。荧光定量PCR结果显示,3种siRNA分子均能够下调PK-15细胞中Tyro3、Axl和Mertk的转录水平,且下调Mertk、Tyro3后CSFV基因组拷贝数均极显著降低,下调Axl后CSFV基因组拷贝数却无显著变化。因此选择siTyro3转染PK-15细胞后以MOI 0.01CSFV-SM感染PK-15细胞,通过荧光定量PCR及间接免疫荧光试验（IFA）检测siTyro3的转录水平以及CSFV的复制情况,结果显示,Tyro3基因的转录水平、CSFV基因组拷贝数及病毒滴度均显著降低,表明下调Tyro3的表达能够抑制CSFV的复制。按常规方法包装制备Tyro3慢病毒Lenti-Tyro3-HA,将其转导PK-15细胞,传10代后每代均经荧光显微镜观察,并将第10代转导细胞分别经荧光定量PCR和western blot鉴定。结果可见转导的细胞每代均发出绿色荧光,荧光定量PCR和western blot结果显示,第10代转导细胞中Tyro3基因的转录水平极显著上升,且可检测到Tyro3的特异性条带。表明获得了稳定表达Tyro3蛋白的PK-15细胞系PK-Tyro3-HA。将CSFV-SM分别以MOI 1和0.1感染PK-Tyro3-HA细胞系后经荧光定量PCR检测,结果显示CSFV基因组拷贝数分别升高了1.5倍（MOI 1）和2.3倍（MOI 0.1）,表明过表达Tyro3后能够促进细胞中CSFV的复制。将不同剂量的兔源Tyro3多克隆抗体（pAb）与PK-15细胞共孵育,封闭PK-15细胞表面Tyro3表位后感染rCSFV-Rluc,经海肾荧光素酶检测,结果显示,20μg/mL和40μg/mL的Tyro3 pAb孵育细胞后再感染rCSFV-Rluc组的海肾荧光素酶活性显著降低,表明Tyro3 pAb能够抑制CSFV的复制。将pCAGGS-Tyro3-HA分别与pCAGGS-E2-Flag、pCAGGS-Erns-Flag共转染HEK293T细胞48 h后,进行免疫共沉淀试验,结果显示Tyro3与CSFV E2囊膜糖蛋白存在相互作用。综上,本研究首次证实Tyro3通过与CSFV E2囊膜糖蛋白的相互作用促进CSFV在PK-15细胞中的复制,为进一步揭示CSFV与宿主细胞的相互作用提供参考依据。

分类号： S852.651

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