同步检测7种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立和应用

文献类型： 中文期刊

第一作者： 王胜强

作者： 王胜强;耿伟光;史成银;李晋;粟子丹

作者机构：

关键词： 鱼类病毒;多重检测;高通量;多重PCR

期刊名称： 渔业科学进展

ISSN： 2095-9869

年卷期： 2016 年 37 卷 04 期

页码： 128-134

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 淋巴囊肿病毒(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原,危害巨大。为实现这7种病原的高通量、同步检测,本研究在分析这7种病毒基因序列的基础上,设计了9组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)引物,并对扩增体系中的Taq酶、M~g(2+)、d NTP、Primer Mix浓度及退火温度等参数进行调整和优化,结合基因芯片检测技术,建立了同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR体系为:Taq酶(2.5 U/μl)1.0μl,10×PCR Buffer(含20 mmol/L的M~g(2+))5μl,d NTP(各2.5 mmol/L)5μl,10×Primer Mix(各2μmol/L)9μl,模板1μl,dd H2O补足至50μl,退火温度为56℃。研究结果显示,该方法可以在1支反应管内对上述7种病毒的9个致病基因同步进行扩增和检测,检测灵敏度分别为10~1copies/μl(RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、10~2 copies/μl(LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和10~3 copies/μl(大菱鲆红体病虹彩病毒,TRBIV)。该方法特异性强,与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法具有高通量、高灵敏度、高准确性的优势,能有效提高工作效率,在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。

分类号： S941.4

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