温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及其一个杀线虫蛋白酶基因的筛选

文献类型： 中文期刊

第一作者： 赵志祥

作者： 赵志祥;芦小飞;陈国华;杨宇红;茆振川;刘二明;谢丙炎

作者机构：

关键词： 土壤微生物;宏基因组Fosmid文库;功能筛选;杀线虫蛋白酶基因

期刊名称： 微生物学报

ISSN： 0001-6209

年卷期： 2010 年 50 卷 8 期

页码： 1072-1079

收录情况： CSCD

摘要： [目的]本研究旨在通过非培养手段构建和筛选宏基因组文库, 以求找到新型的杀线虫蛋白酶基因. [方法]采用密度梯度离心法提取和纯化温室土壤微生物总DNA, 经平末端、连接、包装、转染后, 构建宏基因组Fosmid文库, 同时, 以脱脂奶为底物, 以根结线虫为靶标, 对文库进行功能初筛. [结果]该文库库容 31008个克隆, 平均插入片段36.5 kb, 包含1.13 Gbp的微生物基因组信息, 适合大规模的微生物功能基因筛选, 通过功能初筛, 筛选到1个含杀线虫蛋白酶基因的Fosmid克隆(pro12). 进一步构建和筛选出亚克隆 (espro124a5), 通过对基因结构进行了初步分析发现:espro124a5是一种分泌型胞外蛋白酶, 与来自于 Maricaulis maris MCS10(accession no. YP_756822 at NCBI)的丝氨酸蛋白酶S15仅有45%的同源性, 是一种新型的丝氨酸蛋白酶, 有其保守的催化三元组: Asp_(469)、His_(541)和Ser_(348). [结论]密度梯度离心法提取到的 DNA纯度高、片段长, 完全能满足构建宏基因组Fosmid文库的要求;同时, 构建的宏基因组Fosmid文库库容大, 有利于我们从中筛选其他的微生物基因资源

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