稳定表达Cas9蛋白的C2C12细胞株构建

文献类型： 中文期刊

第一作者： 刘玮玮

作者： 刘玮玮;王伟;杨小淦;唐中林

作者机构：

关键词： CRISPR/Cas9;C2C12细胞株;慢病毒包装体系;基因编辑

期刊名称： 南方农业学报

ISSN： 2095-1191

年卷期： 2024 年 55 卷 010 期

页码： 3169-3178

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】优化慢病毒包装体系并建立能稳定表达Cas9蛋白的小鼠成肌细胞系（C2C12），为基因编辑技术研究提供细胞模型和理论参考。【方法】以C2C12细胞为研究对象，设对照组和试验组，调整三质粒（pmd2.g、pspax2和Cas9）用量配比以优化慢病毒包装体系。利用优化后的慢病毒包装体系将表达Cas9蛋白的质粒（lenti-Cas9-puro和lenti-Cas9-Blast）包装成慢病毒感染C2C12细胞。采用药物筛选富集和单克隆分选获得稳定表达Cas9蛋白的C2C12单克隆细胞株。利用基因组鉴定、免疫荧光染色、sgRNA检测等试验验证细胞株构建情况。【结果】慢病毒包装体系优化后，试验组质粒转染效率达90%以上，极显著高于对照组（80%)(P<0.01）；试验组慢病毒滴度提高至1.8×10～7 TU/mL，极显著高于对照组（6.2×10～6 TU/mL)(P<0.001）。PCR结果显示，C2C12-Cas9稳转细胞株成功扩增出Cas9、puro和BSD序列，外源Cas9序列成功整合到C2C12细胞基因组中，而野生型的C2C12细胞不存在Cas9序列。免疫荧光染色结果表明，C2C12-Cas9稳转细胞株能表达Cas9蛋白。T7E1酶切和Sanger测序结果表明，整合的Cas9蛋白具有切割活性。【结论】通过调整三质粒用量配比成功优化慢病毒包装体系，提高质粒转染效率和慢病毒滴度。成功构建能稳定表达Cas9蛋白的C2C12细胞株，建立了构建稳转细胞株的相对成熟体系。

分类号： Q78

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