文献类型： 中文期刊

第一作者： 宋晓华

作者： 宋晓华;崔尚金;刘剑实;金红

作者机构：

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2000 年 S1 期

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收录情况： 北大核心

摘要： 基因免疫是９０年代初开始发展起来的新方法。１９９０年Ｗｏｌｆｆ等试图用注射方法促使小鼠的肌细胞吸收质粒ＤＮＡ以产生新的蛋白质。设置的对照组在注射ＤＮＡ时未加任何化学佐剂，出人意料的是对照组动物的肌细胞吸收了这种裸露的质粒ＤＮＡ后，能高水平地表达外源蛋白［１］。进一步研究表明，直接给动物接种编码抗原的基因片段可使该动物获得对该抗原的免疫力，即将编码某种蛋白的外源基因直接导入动物细胞可达到免疫接种的目的。所接种的核酸（ＤＮＡ以质粒形式或ＲＮＡ以ｍＲＮＡ形式）既是载体，又是抗原的来源，具有疫苗的功能，可称为核酸疫苗或基因疫苗。１９９５年，世界卫生组织（ＷＨＯ）在日内瓦召开国际会议，将其统一命名为核酸疫苗（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）。 与传统疫苗免疫相比，核酸疫苗具有制备简单，易于保存，免疫反应性良好持久等优点而有望成为第３代疫苗。但也有一些不能令人满意的地方，主要是其免疫机理还不完全清楚，安全性能尚有不同看法，免疫效率也有待提高，这些问题若不及时解决，将阻碍其进一步发展与应用。通过研究表明影响核酸疫苗效率的主要因素包括：质粒的结构，导入的质粒数量，抗原的表达水平，免疫途径，免疫的靶器官，免疫剂量，不同动物品种的株，动物的年龄及抗原对宿主感染的细胞毒性等［２－４］。针对这些问题，人们进行了大量的研究，我们总结认为，提高的效率途径主要在以下几个方面。１在保护性抗原基因选择方面 应选择病原体的主要保护性抗原基因，也可以将具协同功能的基因共同组装入在体质粒。表达库免疫（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｉ－ｂｒａｒｙ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ，ＥＬＩ）是一种很好的筛选保护性基因的工具。其方法是，先消化切割基因组ＤＮＡ，使之成为保护性基因，再将每组片断分别与真核表达载体连接。用全部或者部分基因库给许多动物免疫接种，从而确定病原体基因组中那一部分是有效的免疫保护蛋白。Barryd等用肺炎支原体ＥＬＩ，尽管使用的是部分表达库，但仍能对这些病原体产生有效的保护作用【’一刊２在促进外红艺团表达方面 选择强启动子构建高效表达质粒：启动于类型是影响外源基因表达的主要因素之一。目前多采用ＣＭＶ，ＲＳＶ的启动子可使外源基因得到较好的表达。合适的增强子、内含子。翻译起始序列、ｍＲＮＡ终止信号等因素均可影响外源基因的表达。Ｍｐｅ等比较了两种含流感病毒神经么困酸（ＮＰ）基因的质粒ＶＩ和ＶＪＩ在小鼠体内的表达效果。结果表明，ＶＪＩ的表达水平明显高于ＶＩ的水平。两者的启动于，增强子等均相同，所不同的是在ＶＪＩ的启动于ＣＭＶ内去掉了一段 ５００Ｐｈ的序列，而 ＶＩ的启动子未作任何改动［８］。 选择恰当的免疫途径及方法：一般认为免疫效果与体内的转染率（ＤＮＡｆｆｉ取能力和基因表达水平）和转染细胞提呈抗原蛋白给免疫系统的效率两个因素有关【９）。基因免疫可通过不同的途径进人体内，大部分研究集中在皮内或肌肉途径，实验证明皮内和肌肉注射都可产生高度有效的免疫应答。一种用基因枪直接向免疫组织如皮肤的细胞内递送少量的基因表达载体的方法被证明是非常有效的，基因枪免疫剂量已经确定为几毫微克。尽管在皮下注射后，皮肤细胞能主动地提呈质粒，但只有极少的细胞被转化。而用基因枪传递，被金粒子包被的质粒可穿透皮肤的细胞而溶解。这样，质粒被直接沉淀于细胞内，靶器官的细胞转化高达ｔｏ％。通过改变免疫摄人法，证明基因枪免疫可诱导Ｉｇｈｌ或混合有Ｉｇｈｌｏｐ的反应。此外，基因枪免疫诱发的Ａｌ型的反应能通过加人ｔｈＺ，Ｄ一７或 ｔｈ１２基因，转变为 Ｔｈｌ型反应【３，１０１。３在接种组织预处理方面 Ｄａｖｉｓ等在给小鼠接种质粒ＤＮＡ前１５－３０分钟注射高渗（２５％）蔗糖溶液。结果外源基因表达水平比不作预处理组高，且蔗糖处理组外源基因表达水平较一致，Ｄａｖｉ Ｓ等认为高渗蔗糖可导致组织水肿而使肌束间隙变大，肌纤维通透性增加。这有利于 ＤＮＡ在组织内扩散和被肌纤维摄人［１‘］。ＤａｎｋＤ等报道，免疫前接种部位的肌肉组织用蛇毒或局麻药处理，可使外源基因的表达提高４０倍以上。４在抗原修饰方面 删除功能性序列，如细胞内或跨膜序列可以改善编码抗原的免疫原性卜］。抗原由于添加了引导细胞内运输的序列，可以直接进行１型或血型反应。ｏｖａ－ｏｐｔｏｐｅ在痘苗病毒的应用表明，单独含有 ＣＤＳ＋ Ｔ细胞决定簇的抗原可诱导Ｃ：Ｆ［Ｂ反应［１３） 辅助性抗原决定簇，如类似Ｂ型肝炎的核心抗原能使Ｂ细胞活化，增强对肝炎的强烈的Ｔ细胞应答，从而达到预防肝炎的目的［１４）５在细胞因子协调方百 细胞因子可大大地改善疫苗诱导的免疫反应，加速及引发类似于Ｔｈｌ型或Ａｌ型应答。ｈｉｍ将编码鼠ＩＬ１２和ＧＭ－ＣＳＦ基因的质粒分别与ＨＩＶ～ｌ免疫原的质粒共同接种小鼠，结果都能增强体液免疫反应和促进Ｔｈ细胞增殖。ＩＬ１２还显著增强了 ＣＩＬ反应［‘’ｊ。对于癌症，用细胞因子作为住剂是很重要的，因为一般的肿瘤相关抗原具有低兔疫性。Ｉｗｉｎｅ等证明用基因枪传送的模型抗原仅有保护性，如果与ＩＬＺ，ＩＬ６，ＩＬ７尤其ＩＬ１２一起递送的时候，表现出治疗作用。其他的起住剂作用的细胞因子，包括ＧＭ－ＣＳＦ，被认定为补充和使ｐｏ成熟的细胞因子。除使用合成的方式之外，象质粒ＤＮＡ或ＣＤＮＡ那样被编码的化学激活细胞因子，可调解或加强ＤＮＡ疫苗诱导的免疫反应。一项研究表明，通过融合，可把ＤＮＡ疫苗中的非免疫性抗原转变成化学激活细胞因子中的基因［“］。 被ＤＮＡ编码的协同分子可增强ＡＰＣＳ功能，为了诱发Ｔ细胞应答，Ａ：［ＣＳ必须传递２种信号给Ｔ细胞：一个信号是从ＭＨＣ／ｐｅｐｔｉｄｅ复合物到Ｔ细胞接受器，另一个信号是来自于协同分子，其中Ｂ７可能是最重要并且最好的。当细胞活性因子暴露以后，ｇｒ．ｌ和ｇｒ．２在专职的川℃和其他的各种组织中表达。有趣的是，一些研究中，带Ｂ７．２基因的共同免疫处理，会产生较好的结果，而与Ｂ７．ｌ的有益的的效果很少。我们同样观察到利用基因枪共同传送的疟疾抗原（ｐｌｙＣＳＰ）和Ｂ７．ｌ大大地增加了低效表达的质粒的保护性效果。提高效率在很大程度上依赖于免疫间隔，若间隔时间比较长，用Ｂ７．ｌ重复共同兔疫则受到抑制。值得注意的是只有当２个基因在相同的质粒上被编码，即抗原特异性和协同信号必须产生于同一个细胞，基因免疫的效率才能提高［‘’－”］。６在佐剂与我体方面 免疫刺激序列的细菌ＤＮＡ序列是有效的佐剂：在过去的几年里，关于具有免疫刺激序列（ＩＳＳ）的细菌ＤＮＡ及合成寡核着酸具有ＩＳ效应的报道层出不穷。Ｃｐｃ基序的ＤＮＡ能使Ｂ细胞增殖及免疫球蛋白的产生，并诱导ＩＬ６，ＩＦＮ－。，ＩＬ１２及ＩＬ１８。非甲基化的 ＣｐＧ－Ｏｌｉｇｗｈｎｕｃｌ。ｔｉｄｅｓ（ＣｐＧ－ＯＤＮ），非磷酸化的ＤＮＡ序列，通过免疫刺激ＤＮＡ序列活化肌细胞，ＮＫ细胞（自然杀伤细胞），树突状细胞和Ｂ细胞，能激发初始的免疫反应。因此，免疫中大量应用持粒不但可提高效率，而且可作为性剂促进Ｔｈｌ型应答。已报道Ｃ许ＯＤＮ是一种同弗氏完全佐剂一样效率的佐剂，并且没有明显的毒性。就ＤＮＡ疫苗来说，可以通过ＤＮＡ寡核省酸及增加质粒上的ＩＳＳ数量的方式，提高核酸疫苗的效率【”，’１］。 同源最初促进法（Ｈｍｐ ｐｒｉ————厌③见旧明）提高效率：用没有或几乎没有免疫交叉反应的不同载体（同源最初促进法）携带同一抗原分几次传送给机体的效率要比使用同一种载体（同源促进）的效率高。原因是重复使用任何重组病毒的都会由于机体的免疫记忆而降低效率。Ｌ仍。等报告用牛痘或禽痘为载体，通过同源最初促进法基因枪递送肿瘤抗原，可大大地改善的免疫应答和对肿瘤的治疗。同源最初促进法中使用的载体的顺序非常重要。从初始的简单的抗原载体，到载体越来越复杂可以帮助研究者注意到免疫反应ｐ」。 自我复制型核酸疫苗的高效性：设计自我复制型来核酸疫苗的低效性的想法基于ａ一病毒。这些ＲＮＡ病毒编码自己的ＲＮＡ复制酶，复制在宿主细胞的细胞质中发生，因此独立于宿主的复制系统之外。自我复制型核酸疫苗的主要原理是把抗原编码基因置于ａ一病毒ＲＮＡ复制酶的控制下，以促进抗原的表达和提呈。高水平表达，广阔的宿主范围和细胞质复制都是自我复制型核酸疫苗发展的基础。ａ一病毒的基因组ＲＮＡ也可单独被用作疫苗的载体，从而使疫苗的生产更容易。单纯的肌肉注射自我复制型ＲＮＡ可诱导特异性抗体的 ＣＤＳ＋ Ｔ细胞应答，因而比非复制型 ＲＮＡ的效率要高。ＤＮＡ也可通过插人类似于人类ＣＭＶ介导的启动子／增强子来引发全部ＲＮＡ基因组在核内的转录。少量给机体传送带复制酶的ＤＮＡ疫苗比其它传统的疫苗表现出明显的免疫性和高效性。实际上，毫微克的带复制酶的疫苗就能诱发抗原特异性抗体和ＣＤＳ＋Ｔ细胞应答［２３·Ｍｊ７挑战及展望 核酸疫苗已成为疫苗研究领域中的热点之一，具有广泛的应用前景。大量的动物实验表明，核酸疫苗即可作为病毒、细菌或寄生虫病的预防疫苗，又可用于非感染性疾病及一些复杂难治的疾病的治疗［”ｊ。例如病毒性肝炎、癌症等。特别值得强调的是其研究方向与世界卫生组织儿童计划免疫长远目标（用一种疫苗预防多种疾病）相吻合。这些均已显示出核酸疫苗的巨大潜力和应用前景［地。但是，核酸疫苗的历史毕竟很短，实验结果均来自动物，在用于人体之前还有许多工作必须完成，其中最重要的是解决核酸疫苗对人体的安全性和效力问题，如：须用与人类疾病相关的动物模型证实其效果；须用高度敏感的ｐｅＲ技术等确证所注射的ＤＮＡ不与宿主细胞基因组ＤＮＡ整合，这是确保ＤＮＡ疫苗遗传学安全性的重要指标之一；最终还需要近期和长期的临床试验以明确其毒副作用和免疫保护效果；用ＲＮＡ疫苗替代ＤＮＡ疫苗，由于ＲＮＡ分子不会与染色体ＤＮＡ直接结合，因此可以消除或大大降低转基因细胞内插人突变的可能性。提高核酸疫苗免疫效率的途径@宋晓华$中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽生生物技术国家重点实验室!150001 @崔尚金$中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽生生物技术国家重点实验室!150001 @刘剑实$哈尔滨爱普饲料研究所!哈尔滨150038 @金红$中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽生生物技术国家重点实验室!150001[1] Wolff JA, Malone RW, Williams P, et al. 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