利用sacB基因反向筛选法构建GFP分别融合于猪链球菌MapZ及PBP1b蛋白的融合菌株

文献类型： 中文期刊

第一作者： 卫东

作者： 卫东;陈平;高广娟;朱金鲁;武柳君;刘思国;张跃灵

作者机构：

关键词： 猪链球菌;无痕突变;sacB基因;反向筛选标记

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2022 年 44 卷 011 期

页码： 1149-1155

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为在猪链球菌(S.suis)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据S.suis密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增S.suis中的启动子序列(Peno)及含壮观霉素抗性基因(spc)的片段;再经重叠延伸PCR扩增融合基因片段Peno-sacB-spc(PSS).以相应模板及引物分别经PCR扩增S.suis mapZ基因待融合位点上下游序列UP1和DN1及其pbp1b基因待融合位点上下游序列UP2和DN2、含正/反向筛选标记的片段PSS1和PSS2基因片段,以及用于替换PSS片段的绿色荧光蛋白(GFP)gfp1和gfp2基因片段;再分别通过重叠延伸PCR扩增构建中间菌株的融合片段UP1-PSS1-DN1、UP2-PSS2-DN2以及构建GFP融合菌株的融合片段UP1-GFP1-DN1、UP2-GFP2-DN2.采用同源重组的方法将UP1-PSS1-DN1和UP2-PSS2-DN2分别转化S.suis 05ZYH33菌株,经壮观霉素筛选引入PSS的中间菌株.PCR及测序鉴定结果表明获得了引入PSS片段的中间菌株PSS-mapZ和PSS-pbp1b.将WT、PSS-mapZ和PSS-pbp1b分别培养于含不同浓度蔗糖(10%、7.5%、5%和2.5%)的TSAS平板上,确定WT生长而PSS-mapZ和PSS-pbp1b中间菌株不生长的蔗糖浓度(用于筛选及构建GFP融合菌株).通过比较分析最终确定反向筛选GFP融合菌株的最适蔗糖浓度约为7%.通过同源重组的方法分别将UP1-GFP1-DN1片段转化PSS-mapZ菌株、UP2-GFP2-DN2片段转化PSS-pbp1b菌株,分别经含7%蔗糖(生长)及含壮观霉素(不生长)的TSAS平板筛选.随机选择经筛选获得的100个单菌落计算筛选的阳性率.各取6个单菌落经PCR及测序鉴定.结果显示,筛选菌株的阳性率在52%~75%.PCR及测序结果显示,获得的两种重组菌株中的gfp基因片段确实分别替换了PSS-mapZ和PSS-pbp1b中的相应PSS,表明正确构建了融合GFP的重组菌株GFP-mapZ和GFP-pbp1b.本研究首次构建了高效的正/反向筛选标记PSS,以及无痕的S.suis GFP-mapZ和GFP-pbp1b融合菌株,为快速无痕的S.suis遗传操作及深入研究S.suis相关分子机制奠定了基础.

分类号： S852.61

  • 相关文献

[1]枯草芽孢杆菌sacB基因的功能验证及应用. 吴菁,刘秀敏,张维,陈明,林敏. 2008

[2]枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因转化小麦的研究. 刘伟华,赵秀振,梁虹,刘文献,胡赞民,李立会. 2006

[3]猪链球菌病的检测方法研究进展. 谭娅,史开志,王婧,尚以顺. 2016

[4]猪的三种新发细菌病研究进展. 黄金海,王英珍,丁伯良. 2000

[5]三种新发细菌性猪病研究进展. 黄金海,王英珍,丁伯良. 2000

[6]猪链球菌感染的诊断与控制治疗. 毛君婷,杜春林. 2016

[7]运用液体通气培养方法制备猪链球菌灭活疫苗试验. 甘伏生,杨涛,周萍,程琪荣,李玉华,孟丽. 2009

[8]东北地区猪群链球菌分离鉴定及流行病学调查分析. 王淑杰,雷连成,徐敏,孙长江,李成君,蔡雪辉,刘永刚,张琦,刘狄热,石文达. 2009

[9]甘肃省健康猪群猪链球菌分离株的耐药性检测. 邢娟,李学瑞,柳纪省,胡永浩. 2011

[10]江苏省某猪场猪链球菌分离鉴定及致病特性分析. 周俊明,王丹丹,倪艳秀,祝昊丹,孙珂,李彬,俞正玉,吕立新,何孔旺. 2020

[11]河南一起2型猪链球菌病的诊断与治疗. 朱文豪,王治方,张青娴,许峰,方剑玉,徐引弟,李海利,王克领,焦文强. 2020

[12]猪链球菌蛋白表面展示系统的构建及展示蛋白的初步观察. 黄萌萌,刘冉,陈平,朱金鲁,卫东,谢芳,李刚,刘思国,张跃灵. 2020

[13]湖北省一例猪链球菌的分离与鉴定. 高婷,袁芳艳,刘泽文,刘威,周丹娜,杨克礼,段正赢,郭锐,梁婉,焦祖武,田永祥. 2018

[14]猪链球菌流行优势菌株的调查及耐药性. 王治方,白红杰,徐引弟,朱文豪,张青娴,焦文强,李海利,许峰,王克领,张彬,娄治国. 2020

[15]猪流行性腹泻与链球菌混合感染诊断分析. 赵海忠,李良华,宋忠旭,孙华,彭先文,梅书棋. 2020

[16]猪链球菌乳酸脱氢酶基因的原核表达及重组蛋白的反应原性研究. 高明明,王淑杰,王俊,金家民,张璐,刘永刚,李爱东,陶冶,李莉. 2015

[17]猪蓝耳病病毒与副猪嗜血杆菌及猪链球菌混合感染的诊治. 许艳华,李富强,董志民,田向学,任卫科,路超. 2022

[18]2017年我国4个省份屠宰场猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析. 王长珍,刘文宇,祝瑶,栾天,于淼,杨亲,刘思国,张万江. 2019

[19]猪链球菌相关毒力因子研究进展. 李仕新,李家侨,李婉雁,庞木生,李春玲,臧莹安. 2011

[20]猪链球菌对红霉素耐药性的研究. 李艳华,姜成刚,蔡雪辉,童光志,刘娣,佟恒敏. 2006

作者其他论文 更多>>

微信小程序