基于ANP32蛋白的B型流感病毒聚合酶的纯化及其单克隆抗体的高效制备

文献类型： 中文期刊

第一作者： 纪玉洁

作者： 纪玉洁;郭兴;张振宇;王晓钧

作者机构：

关键词： B型流感病毒;RNA依赖性RNA聚合酶;ANP32蛋白;单克隆抗体

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2022 年 002 期

页码： 162-168

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为同时制备B型流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）各亚基（PB1、PB2、PA）的单克隆抗体（MAb），本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B（111-C）-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用，将表达IBV RdRp各亚基（PB1、PB2、PA）的质粒与表达鼠muANP32B（111-C）-flag的质粒共转染ANP32A/ANP32B双敲除的293T细胞（DKO细胞），36 h后通过免疫沉淀（IP）试验，富集并纯化RdRp（由PB1、PB2、PA亚基组成），经SDS-PAGE检测获得了纯度较高的ANP32B（111-C）-RdRp复合物。以纯化的该复合物免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA方法筛选能稳定分泌IBV RdRp和ANP32B（111-C）特异性MAb的杂交瘤细胞株。利用western blot鉴定各杂交瘤细胞株分泌MAb所结合的RdRp亚基。从获得的各种MAb中分别选取效价最高的1株制备小鼠腹水，利用间接ELISA方法测定各腹水的效价。将表达A、B、C、D型流感病毒RdRp各亚基（PB1、PB2、PA）的质粒分别转染293T细胞，24 h后裂解细胞，利用所制备的RdRp各MAb经western blot鉴定其交叉反应性；分别将表达不同物种ANP32B蛋白的质粒转染DKO细胞，24 h后利用制备的muANP32B（111-C）MAb经western blot鉴定。上述试验结果显示，共筛选到27株阳性杂交瘤细胞。Western blot结果显示，获得了多株稳定分泌PB1亚基、PB2亚基、PA亚基及muANP32B（111-C）MAb的杂交瘤细胞株；间接ELISA结果显示，上述各类MAb制备的小鼠腹水最高效价为1:1.28×105～1:6.4×104，分别命名为1D10、1E9、2E9、6C7。Western blot结果显示，制备的IBV RdRp各单亚基MAb均能与IBV RdRp对应单亚基蛋白发生特异性反应，而不与A、C、D型流感病毒RdRp对应的单亚基反应，表明各MAb对IBV的特异性较强；其中MAb 6C7可以识别鼠、人、鸡、牛、猪、犬的ANP32B蛋白及鸡的ANP32A蛋白，表明该MAb的物种广谱性较好，可用于不同物种ANP32蛋白的检测。将MDCK细胞感染IBV，并分别以转染IBV RdRp各亚基质粒的293T细胞作为阳性对照；培养鼠源SP2/0细胞，并以转染muANP32B质粒的DKO细胞作为阳性对照，利用制备的MAb分别经激光共聚焦试验检测病毒RdRp各亚基在MDCK细胞及muANP32B在SP2/0细胞中的定位。结果显示，各MAb均能够与细胞中病毒RdRp各单亚基及SP2/0细胞中的内源性muANP32B蛋白反应，出现相应荧光。且PB1、PA亚基及内源性muANP32B主要定位在细胞质，PB2亚基主要定位在细胞核。本研究首次利用ANP32（111-C）蛋白富集IBV RdRp，并采用免疫ANP32（111-C）-RdRp复合物的方式同时获得了针对IBV RdRp 3个亚基和ANP32（111-C）蛋白的4株MAb，且能识别出多种与IBV感染相关的关键互作蛋白，可为IBV相关研究及检测提供有效的技术支持。

分类号： S859.797

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