文献类型： 中文期刊

第一作者： 孔平

作者： 孔平

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期刊名称： 中国蔬菜

ISSN： 1000-6364

年卷期： 1992 年 1 卷 04 期

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收录情况： 北大核心

摘要： 自Carlson(1973)筛选出第一种植物细胞抗病突变体——烟草抗野火病突变体以来,已有17种作物抗50余种病害的突变体问世,据统计在各种生物技术手段中突变体筛选技术是迄今得到抗性新材料或品系数目最多最广泛的,其中有近1/3的抗病突变体是蔬菜类的,这说明抗病突变体筛选技术无论对该技术本身的发展还是满足蔬菜育种或生产的需要都是十分值得总结和进一步探讨的。本文在概述突变体筛选技术一般程序和特点的基础上,对蔬菜抗病突变体筛选技术从选材与筛选两个方面作一简要的综述。 特点与程序 与其它育种技术相比,突变体筛选技术具有以下特点:①利用体细胞无性系变异的特点和其它增加变异的方法,使变异或突变有利于抗病新种质的创造;②突变体后代稳定快,抗病性一般能在当代表达,R2代便可以获得稳定遗传;③可根据育种目标针对品种的个别缺点(如抗性差或无抗源)进行改良,同时还能增加其它辅助特性创造多抗性而不使其原有的其它优良性状改变;④取材方便,节约空间和时间,选择效率较高I⑤通过细胞筛选可以激活某些潜在的稳定性状(如耐萎性、雄性不育性等),开发品种的遗传潜力。 植物抗病突变体筛选的工作程序可归纳成下列框图(图1),其中的两个分支一个为选择的,另一个为非选择的。前者通过细胞培养物在选择的(加有病菌或其代谢物)和非选择的(不加选择剂)培养基上的交替继代或在高浓度选择培养基上的一次继代筛选抗性的细胞或组织;后者细胞阶段只在普通培养基上单纯继代并不加选择。稳定性和均一性试验是为检测培养物抗性设计的,如果在细胞阶段培养物与选择剂的作用不充分,抗性不稳定就会在植株阶段得出错误的结果。该程序实作时可按需要增减某些步骤。 选材 供试材料基因型和外植体的选择是突变体筛选技术成功与否膝关键。目前这项技术所以进展缓慢,一方面是所选择材料本身无农用价值,另一方面是供试材料的遗传背景不清楚或被选择的性状与其它不良性状有连锁经不起生产上其它逆境的考验,以及供试材料不能形成完整植株,或即使形成了植株但摆脱不了异养环境而夭折或抗性在植株水平根本不表达。这些情况提醒我们在选择基因型时除了应考虑选择有实用价值的材料外,还应考虑其再生性和目的基因在细胞和植株水平表达数目和序列的一致性;而在选择外植体时除应考虑建成一套简单、短期、经济和可重复的细胞培养和再生技术外,还应考虑采用单细胞培养物(最好是单倍体)并弄清目的性状的遗传和生化基础。目前最接近上述要求的只有茄科植物的叶肉原生质体,用原生质体的优点是可以避免或限制嵌合体形成,并且可以达到供选细胞均一地感染选择剂(病菌或病菌代谢物)。例如,Shepard(1981)用马铃薯的叶肉原生质体不但选到了4个抗马铃薯早疫病的稳定突变体,而且选出的突变体在产量和成熟度方面也获得了令人满意的结果。但是,原生质体培养的技术难度较大,由此形成的后代稳定性也不理想(David等1989),因而有人提议用胚作筛选材料,认为每个胚都可以产生正常可育的植株,并可用已建立的种子诱变技术使其产生突变,而且也使染色体的受伤少。但FliCk( 1984)认为突变细胞在有分化结构的组织中并不易成活且诱发的变异没有无性系变异的范围大。现在折衷的办法是用外植体诱导愈伤组织及悬浮培养物,这样既能限制嵌合体形成(不定芽往往只发生自少数几个甚至单细胞)又可以使突变细胞易于存活,还可以最大限度地利用无性系变异。大多数人倾向于用单倍体无性系(如花粉、子房),认为其变异频率比2倍体大且无显隐性差异易于性状选择。Behuke等 (1980)成功地用马铃薯双单倍体叶肉细胞_诱导出愈伤组织,获得了抗马铃薯晚疫病4个致病菌株的突变体植株,使这一作法的可行性更加肯定。 筛选途径 一、选择与分离 (一)活菌作选择剂要从培养物中分离出抗病性的细胞,就必须使用某种与病害反应密切相关的选择剂。最直接的方法就是用活菌作选择剂,但关键是要保证病原物与培养物充分接触以便选择真正表达抗性的细胞或组织。然而要做到这一点并不容易,相比之下,活菌法在筛选抗系统侵染的病毒病突变体上是较成功的( Murakishi等1984)。虽然蔬菜上还无有关报道,但其方法是可借鉴的,特别是原位选择法( insituselection)( Murakishil982),其要点是:用受系统侵染的外植体先进行诱变处理,如X射线,再在高剂量细胞分裂素和高光照下培养继代使细胞脱毒或产生抗性,然后挑出生长迅速的(松散的)愈伤或绿岛组织再生植株,最后挑选健康植株进行抗病性鉴定。真菌病方面也有人用原位选择法取得了良好结果(Prasad等1984)。总的来看活菌筛选法应用并不多,蔬菜上的一例是Pn’llman等(1983)报道的,他们将芹莱的芽置于含Fusar。。。 oxysPorum f.sP.PPii病菌的培养基上选择抗病的愈伤组织再生植株获得了抗萎蔫病性的突变体,但他们没有提供后代抗性遗传的情况。细菌病方面有人用细胞培养物与细菌活菌共培养的方法(孙立华1986)筛选到了植物抗细菌病的突变体,但蔬菜上尚未见到实例。 活菌筛选法使用有限的直接原因为抗性细胞选择和分离困难。前者可因细胞水平和植株水乎抗性表达上的不同而影响选择的结果,因此确定与植株水平趋于一致的细胞抗性表达方式亟待解决。目前的办法是:①比较抗病和感病材料培养物接种病菌后的反应制定相应的选择标准,②观测寄主和病菌反应选择有过敏反应的细胞;③在排除培养条件(如激素、渗透压)干扰后选择生长快速的细胞(Daub 1986)。至于从培养物中分离抗性植物细胞,由于在病菌和寄生都处于异养的情况下,病菌的生长速度往往较快,时常将细胞培养物覆盖或裹住做起来很不容易,不过随着分离手段的改进这个问题是有希望解决的。最近发展的双边培养法( Peterson 1990)对此可能会有所研益。 (。)病前代谢物作选择剂一直非常盛行的抗病突变体筛选方法是用病菌毒素作选择剂,可以克眼用活菌筛选病菌感染不匀的缺点,使病菌毒素能与培养基混匀并与培养物充分接触,而且无论是采取一步法(在选择培养基上用致死剂量只选一次)或者逐步法(用足够长的时间多次在选择培养基上选择、剂量逐步加大)使用的剂量也易设计,同时突变体也易分离。蔬菜上用毒素或粗毒素(病菌培养滤液)作选择剂现已筛选到突变体不下10种(表1),其中一部分的遗传类型已得到肯定,并且许多情况下再生的突变体(RO)的抗性到R;代植株时还会有明显增加并遗传给后代。 二、植株再生后的一次选择 近年来也有许多在细胞阶段不通过选择直接获得抗病变异体的例子(表2)。利用体细胞无性系变异高度稳定和可遗传的特征(Larkin等1981)在植物再生后用一般的抗病鉴定方法进行抗性的筛选,有时显得很有效。例如,Toyoda(1989)筛选的遗传上表现完全抗性的番茄抗青枯病植株恰恰是未经细胞选择的S相反,用pseu domonas solanla毒素经细胞选择的番茄植株却只获得了部分抗性。当然并非所有采用这种方法选择的结果都令人满意,如Smith(1990)通过无性系选择番茄TMV抗性时效果就不明显,突变体的抗性偏低并且只对个别病毒株系(Tin-1)有效。许多研究者将细胞选择和不选择的结果作比较后发现,先用选择剂筛选细胞培养物可以明显提高抗病突变体的获得率。 该方法的明显优点是不需通过细胞筛选就可得到一些抗病表型,这在无适合的毒素时不失为一种实财的方法,因此它可对任何细胞操作技术的副产物加以利用,如花培、细胞融合、基因转化等。但它也存在一些弊端,一是随机性大、目的不明确,即使获得了大量植株也很难保证选到理想的品系;其次,该法难以从高度感病的亲本中选出高抗的变异体,亲本的低水平抗性只会由基因剂量效应(gene-dosage effec)在无性系变异中简单加倍(Latunda 1983);第三,无性系变异常引起多种性状的改变,著选择不及时就会导致选到的特性朝不希望方向变化。 展望 尽管抗病突变体筛选技术在蔬菜育种上的应用仍很有限,但其今后发展对蔬菜抗病育种的影响则是难以估量的。用这种方法解决当前常规育种中抗源缺乏、特别是育成优良品种的抗性退化以及虽有抗源但杂交不亲和等问题前景可观。可以预测,随着组培技术、植物病害生理学、遗传学以及生物化学等研究的不断深入,通过对该技术的内部改造,将有更有效的选择方法问世从而使其在蔬菜育种上的应用有较快的发展。抗病突变体筛选技术及其在蔬菜上的应用@孔平$中国农科院蔬菜花卉所!北京1000811孙立华等.用组织培养法筛选抗白叶枯病突变体.遗传学报,1986(3):188～193 2 Behnke, M. Z. Pflanzenzuecht, 1980, 85:254-258 3 Daud, M.E. Ann.Rev. Phytopathof, 1986,24: 159-186.. 4 David, A.E.Newsletter nit. Assoc. PlantCult ., 1989.54 5 Evans, D. A. et al. Am. J. Bot., 1984,71: 759-774 6 Harison, G.D. et al. The use of protoplast in plant virus research. In: Use oftissue culture. and protoplasts in plantpathogen eds J.P.Heigeson et al ., 1983, 67~l 37 7 Latunda-D ada. A.O. et al.Plant Sci.Lett .,1983, 32: 205-212 8 Matern, S.A. et al. Proc Natl. Acad.,. Sci., USA 1978, 75 : 4935-4939 9 Miler, S.A. et al. Phytopathology, 1985,75: 1354 (Abstr. ) l0 Murakishi, H. Adv. Cell Cult., 1984.(3):l ~55 11 Peterson, M.T. et al.Agri cell Rep.,1990,14 (6 ): 42 12 Prasad, B. Current Sci. 1984, 53 : 816~817 13 Pullman, G.S. et al. Hortscience, 1984,19: 589 (Abstr. ) 14 Shahin, E.A. et al. Theor. Appl. Gene.1986,73 (2 ) : 164-169 15 Shepard, J.F. et al. Ann. Rev. Phytopatthol, 1981, 19: 145-166 16 Smith, S.S. et al. Phytopathology, 1990,80(10 ): 966 (Abstr. ) 17 Toyoda. H. Plant Cell Rep., 1989,8 (6 ):317-320 18 Wenzel, G. Ann. Rev. Phytopathol, 1985,23 1:149~ 172 19 Wright, J.C. et al. Phytopathology, 1985,75: 967 (Abstr. )

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