文献类型： 中文期刊
作者： 杨坤 1 ; 吴学龙 2 ; 朗春秀 3 ; 陈锦清 4 ;
作者机构： 1.浙江师范大学化学与生命科学学院
2.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所
3.浙江省植物基因工程代谢重点实验室
4.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所浙江省植物基因工程代谢重点实验室
关键词： 反向PCR;侧翼序列;改良CTAB法;转基因油菜
期刊名称： Agricultural Science & Technology
ISSN： 1009-4229
年卷期： 2010 年 02 期
页码： 71-74+145
摘要： [目的]优化反向PCR(IPCR)条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用SDS法和改良CTAB法(包括低温操作、增加酚氯仿的抽提次数以及延长低温沉淀时间等)提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再使用普通聚合酶与热启动高保真的ExTaqHS聚合酶进行两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。油菜数据库比对搜索采用BBSRCBrassicaDB上WU-BLAST2.0工具,拟南芥数据库比对分析采用TAIR数据库中WU-BLAST2.0工具。为验证FS4转基因中T-DNA插入位点的真实性,根据序列比对分析结果在T-DNA插入位点的左右两端分别设计引物FS4-L与FS4-R。分别采用3对引物pS2/FS4-L、pA2/FS4-R、FS4-L/FS4-R同时对T1代转基因FS4杂合体和非转基因对照植株的基因组进行PCR验证。[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。
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