文献类型： 中文期刊

作者： 李明远 ¹ ; 柯常取 ¹ ; 曾丽 ¹ ; 严红 ¹ ;

作者机构： 1.北京市农林科学院植保环保所

期刊名称： 中国蔬菜

ISSN： 1000-6364

年卷期： 1990 年 1 卷 04 期

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摘要： 芸薹链格孢[Alternaria brasstcae(Berk.) Sacc.]是我国秋播大白菜黑斑病的主要病原。由于该菌的某些生物学特性所决定,在利用其进行大白菜苗期抗病性鉴定时,往往因病原分离不准,菌种的退化、产孢的困难、选择压力的不稳定等问题使鉴定失败。近年来我们针对这些问题开展了一系列的研究,得到一些结果,现发表出来与从事这方面工作的同行商榷。 病原菌的分离问题 芸薹链格孢是一种兼性寄生菌,个体间生物学差异大。在研究时,一般用组织分离法进行病原菌的分离纯化。由于该菌在PDA上生长得慢,往往先长出的是伴生腐生菌细交链孢[Alternaria alternata(Fries)Keissier]。加上芸薹链格孢的多数菌系在PDA培养基上不易产生孢子,往往难以在早期确定哪种菌落是病原。甚至出现把细交链抱误以为病原的情况。为了克服这一困难,我们利用了会蔓链格抱菌分生抱子个体大,便于由组织中诱发出来的特点,采用由病斑上直接挑取抱子接在PDA培养基上的一方法,分离该菌的单班系或单抱子系,取得了良好的效果。采用此法挑取抱子的病叶可以是干标本(腊叶标本),也可以是鲜标本,先用冷开水及无菌水清洗病斑表面的尘土及老抱于,再放在铺有湿的消毒滤纸的灭菌培养皿内,”在 15～ 2 0 oC下保湿 12～ 24 /J’时.待病斑上出现大量抱子时即可在无菌室内(或超净台上)置于双简镜下挑取他子。挑取抱子的挑针要细。为了避免细菌的污染,可在每皿PDA培养基中加2滴25%的乳酸。每皿挑入10～20次,然后放在20～25℃温箱内培养约1周,即可得到纯化的苦基链格抱菌或其单抱子菌系。 供试菌种的退化问题 答基链格抱在人工培养基(如PDA)上转移的过程中,菌丝生长、产抱及侵染力都会逐渐减弱。如Ah—7菌系在PDA上转移18次后,不仅生长缓慢,不产抱,而且不能侵染大白菜。如果继续使用这样的菌系接种,必然会影响到抗病性鉴定的结果。因此,如何保持鉴定用菌致病力长期稳定,已成为准确鉴定大白菜对黑斑病抗性的重要保证。 为了解决这.一问题,作者曾采用过早代大量繁殖菌种,放在0～4t冰箱中保存的方法。但由于该菌在这种温度下仍可缓慢生长,退化的问题仍未解决,菌种仅能保存一年。此外,还用了石蜡油封藏法。但往往因杂菌的污染而使菌种报废。最后我们采用了千藏病组织的方法,解决了菌种长期保存会退化的问题。 具体的做法是;将分离到的芙董链格抱的单抱子系,以每滴20～80个抱子(或菌丝段)的量,滴接在白菜子叶上,5～7天后采F病叶,制成腊叶标本,放在两端加有干燥剂的玻管中,置于一18—一20℃温度下保存。用时取出一片,山病斑上直接挑取抱子分离出胶原首。由于干叶中的病菌在一18℃下低温中可以保存数年(作者已藏2年多,产抱力无变化)。因此,可以长期使用,保证了病原致病力的稳定。 病原菌抱子诱发技术 一般的说,芜望链格抱在寄主叶片上是很容易产生抱子的。但是用作抗病鉴定的病菌要经分离培养及纯化,使用其单抱后代。而该首在一般人工培养基上又不易产抱。因此,诱发该菌在人工培养基上产抱成为进行抗病鉴定的难题之一。为了解决这一难题,作者曾做过许多尝试,结果表明用玉米粒培养基产抱效果最好。具体做法是:将玉米粒煮熟,灭菌后接种芙塞族格抱菌苔,在25℃下培养9天,再经日光灯( 40W)在距离15厘米处照射2～4小时。在20C下黑暗中保湿48小时,然后每10克分装在一个小三角瓶内,置于一18—一20℃冰箱中保存。需要使用时取出一瓶,经刷洗抱子即可使用。洗过的产抱基物,可每保温48小时吸取一次抱予,连续使用3～5次。以第2次的抱子最适于进行抗病鉴定使用。这种抱子诱发工作一年进行一次即可。存于冰箱,随用随取. 综上所述,大白菜苗期抗黑斑病鉴定的病原菌繁殖工作,可用下列示意图表示。 接种用施子浓度 的计测方法问题 在进行大白菜抗黑斑病苗期鉴定时,用的抱于浓度对鉴定的结果影响很大,为此必须准确的计测使用悬液的抱子浓度。目前报道的计测方法很多。最一般的是将抱于悬液滴在载玻片上,加盖片后在低倍镜下(10X 10)任意统计10个视野中的抱子数。平均后,推算出每毫升悬液中的抱子数。但在我们使用中发现这种方法与观察的视野位置关系很大,在盖片中间取样比在边缘取样高数倍之多。作者重新分析了一滴悬液加盖后的抱子分布,表明在未加盖片前液滴所占据的部分,抱子密度最大,其外的抱子密度明显下降。因此,任意取10个视野的抱子量来代表全滴往往是不准确的。作者还比较了用血球记数板计测结果与实际抱子量的误差。每次均明显的高于实际抱子量。经过试验,我们认为取样时应在距盖片两端 1/4处取两个样比较简便准确(图2)。此处还可以将抱子悬液稀释到一定容积,充分摇句后立即用滴管吸出5滴,滴在载片上,不加盖片(这样观察面积小,省时间)。在显微镜F统计每滴中的抱子数,求出平均值。同时统计一下所用满管滴一毫升的滴数(重复3次平均),按下列公式即可求出每毫升悬液中的抱子量: 每毫升悬液中的抱子量。5滴悬液抱子平均数 X使用摘管每满1毫升悬液的滴数 根据计测的抱于浓度,用容量计算法(l)求出配成适合浓度应加水量。在熟练后,只需统计一下一滴中的抱子数,即可掌握进行抗病鉴定所需加入的水量。目前我们使用每毫升滴50滴的滴管,使每滴中抱子数控制在20个左右进行接种,即可得到良好的筛选效果。 关于改进滴接鉴定法问题 目前在进行大白菜苗期抗黑斑病的鉴定时,一般使用注射器滴接。依其针头固定的孔径保证抱子液滴体积的稳定。还要求在接种过程中不断翻摇注射器,以免因抱子沉降影响接种浓度。但是,试验表明这种方法比较麻烦,不如用改进液管法。具体方法是将6号注射器针头截断,用酒精灯烧接在液管上吸取抱子悬液滴接,这样既提高了接种效率,又保证了液滴体积的一以此外还观察了满接过程中不摇动,抱子沉降时对液滴抱子浓度的影响。做法是将滴管内吸满抱子悬液(约73滴),分别收取第l～3,11～13,21～23, 41～43, 71～73滴来计测各滴中的抱子数,结果表明随着滴数的增加,每滴中的抱子量在下降,每滴平均抱子数分别为397.7、382.3、379.0. 365.3、331.7,但经方差分析,差异不明显(区组间F值2.20,处理间 F值 1. 34 3)。因此,没有必要在接种时翻摇注射器,可进一步提高接种的效率。关于大白菜苗期抗黑斑病鉴定中几个技术性问题的商榷@李明远$北京市农林科学院植保环保所 @柯常取$北京市农林科学院植保环保所 @曾丽$北京市农林科学院植保环保所 @严红$北京市农林科学院植保环保所[1]方中达,《植病研究方法》,农业出版社,1977.p23