文献类型： 中文期刊

作者： 周文林 ¹ ; 藤原晴彦 ² ; 上村望 ² ; 叶爱红 ¹ ; 武雪会 ¹ ; 陈学东 ¹ ; 张婷婷 ¹ ; 曹锦如 ¹ ;

作者机构： 1.浙江省农业科学院蚕桑与茶叶研究所

2.东京大学大学院新领域创成科学研究科先端生命科学专攻

关键词： 家蚕;电穿孔;转基因;Wnt1;RNAi;基因功能

期刊名称： 昆虫学报

ISSN：

年卷期： 2021 年 007 期

页码： 809-816

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】明确基于电穿孔的基因功能分析方法在家蚕Bombyx mori活体内的应用实效。【方法】针对调控家蚕幼虫体表斑纹黑色素合成的靶基因Wnt1 （Wingless）,人工合成特异性siRNA,向4龄第3天家蚕幼虫注射Wnt1 siRNA并进行电穿孔作为处理组（ERFA-RNAi）,以注射Wnt1 siRNA但未进行电穿孔的幼虫作为阴性对照组（negative control, NC）,解剖5龄幼虫斑纹区的表皮,用实时定量RT-PCR测定表皮中Wnt1的相对表达量,验证电穿孔介导的RNAi效果。带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP和红色荧光蛋白报告基因DsRed2表达元件的转座子载体pPIG-A3GR,通过电穿孔导入家蚕2龄幼虫;正常饲养72 h后,用荧光体视显微镜观察幼虫中EGFP和DsRed2的表达,验证当世代家蚕的嵌合体转基因。【结果】家蚕4龄第3天幼虫中导入Wnt1的特异性siRNA后,5龄幼虫体表特定部位斑纹的形成明显受到抑制,实时定量RT-PCR分析表明5龄幼虫表皮中Wnt1的表达水平显著降低。嵌合体转基因家蚕的阳性率达56.60%,并且两个荧光报告基因EGFP和DsRed2在幼虫、蛹及成虫期持续表达。【结论】电穿孔技术可快捷、高效地向家蚕活体内导入外源RNA或DNA,是家蚕乃至其他昆虫基因功能解析的有效方法。