文献类型： 获奖成果

作者：

获奖名称： 科技进步奖

获奖等级： 三等奖

关键词： 检测技术;类病毒;技术;检测;分子检测技术;分子检测;马铃薯病毒;复合;分子;马;马铃薯;病毒

第一完成单位： 河北省农林科学院经济作物研究所

获奖时间： 2007

摘要： 任务来源： （1）河北省科技厅“马铃薯病毒和类病毒复合RT-PCR分子检测试剂盒研制”，2004－2005，项目编号04225505。 合同指标： （1）研制成马铃薯病毒和类病毒复合RT-PCR分子检测试剂盒，面向生产单位推广应用。 （2）研制出的复合病毒检测试剂盒可请专利。 （3）在国内核心期刊发表论文3～4篇。 按照课题任务说要求，经过2001－2005年的研究，全面并超额完成合同技术指标，取得了如下技术成果： 1、建立了从马铃薯组织中提取植物总RNA的改良CTAB方法，该方法提高了RNA样品的纯度，增强了检测的准确性。 在原有的CTAB法提取DNA基础上，增加LiCl选择性的沉淀RNA，沉淀的RNA经过SSTE缓冲液进一步去除酚类物质和多糖，有效地消除了马铃薯组织中的酚类物质和多糖等对RT-PCR反应的抑制性影响，从而建立了马铃薯病毒和类病毒RNA提取的改良CTAB方法。该方法价格低廉，成本不足进口试剂盒的1/50；该方法提取温和，在提取的时候采用室温离心，对仪器设备要求较低，一台普通的离心机就能完成RNA的提取，实践证明该方法是一个快速、经济、可靠的马铃薯病毒RNA提取方法。 2、首次建立了以马铃薯组织线粒体NADH脱氢酶亚基NAD2基因为RT-PCR检测的内对照，有效地解决了检测过程中存在的假阴性问题。 针对病毒复合RT-PCR检测过程中容易产生假阴性结果的问题，在马铃薯病毒检测体系中引入线粒体NADH脱氢酶基因NAD2亚基作为内对照，设计的引物跨越该基因的内含子区域，只对剪接后的mRNA进行特异扩增，而不对其DNA进行扩增。利用该内对照进行马铃薯病毒和类病毒复合RT-PCR检测，能够更好的对病毒RNA提取过程和RT-PCR检测结果进行监督。本项研究建立的以植物基因组mRNA为病毒RT-PCR检测内对照的技术与思想可广泛应用于植物RNA病毒的RT-PCR检测。 3、建立了可同步检测多重侵染马铃薯病毒和类病毒的复合RT-PCR检测技术体系，组装了复合RT-PCR检测试剂盒， 针对马铃薯病毒和类病毒独立设计出了特异性引物，设计的引物特异性强，无相互干扰，容易区分，能检测出这些病毒和类病毒的不同株系。研究建立了可同步检测多重侵染马铃薯的马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒等5种病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒的复合RT-PCR分子检测技术体系。在检测中，如果仅出现190 bp片段者，则为健康样品；若无190 bp的DNA带出现，则为假阴性样品，需要继续进行检测确定；若190 bp片段和其他片段同时出现，则为感病样品，其中PVX的扩增带为520 bp，PVY的扩增带为420 bp，PVA为410 bp，PSTVd为360 bp，PVS为310 bp，PLRV为270 bp。该检测试剂盒大大提高了检测灵敏度、降低了检测成本，对解决长期以来马铃薯病毒检测难的问题具有重要作用。 4、从分子水平上首次系统地对河北省马铃薯主要病毒和类病毒的流行株系进行鉴定，并对其分类地位进行了分析评价。 根据国际植物病毒分类委员会（ICTV)第7届植物病毒分类规定，同种病毒不同株系的外壳蛋白基因序列的同源性达到85%以上，氨基酸序列的同源性高于80%，因此外壳蛋白基因序列和氨基酸序列的同源性常常作为病毒分类的主要依据。对河北省的马铃薯病毒和类病毒进行了株系的分子鉴定研究，通过国际基因库收录的马铃薯病毒和类病毒序列进行系统进化树分析，从分子水平上首次科学的评价了河北的马铃薯病毒和类病毒的流行株系的分类地位。 5、克隆了5种主要马铃薯病毒的外壳蛋白基因序列和1种类病毒的基因序列，并被国际基因库（GenBank）收录，登录号分别为PLRV（DQ315385）、PVY(AY660662)、PVX(DQ315386)、PVS(DQ315387)、PVA(DQ315384)和PSTVd (DQ315388)，这些基因具有自主知识产权。 6、复合RT-PCR检测技术应用。 本项技术可广泛应用于脱毒马铃薯种薯和种苗的室内检测、生产田检测、抗毒病毒材料的鉴定、筛选及植物检验检疫等方面，应用前景非常广阔。2003～2004年河北省高寒作物研究所和农业部薯类产品质量监督检验测试中心（张家口）主持和承担了农业部“全国马铃薯质量普查”任务，该项技术被作为主要检测技术而采用，并与传统的ELISA和双向电泳法进行了比对，实践表明该技术具有更高的稳定性、灵敏度和准确度。利用该技术育成了冀张薯7号、张薯9号、张薯90-2-10三个高抗病毒病和类病毒病的马铃薯新品种，同时建立了种薯质量检测和监控体系，对生产上大量使用的马铃薯种苗和种薯如：费乌瑞它、大西洋、夏波蒂、早大白、早大黄和张薯系列品种进行大规模的病毒检测，获得了大量核心的脱毒马铃薯种薯和种苗，并生产出高质量的种薯，在全国7省（区）推广应用，促进了马铃薯生产的良性发展，节约了大量人力和物力，产生了巨大的经济效益和社会效益。 7、发表论文 本项目在国家核心刊物上已发表论文5篇，并多次被国内高校、科研单位等引用。其中《园艺学报》上发表论文1篇，《华北农学报》发表论文1篇，《河北农业大学学报》发表论文3篇。投稿到《园艺学报》1篇；《中国农业科学》1篇，《河北农业大学学报》1篇，《华北农学报》1篇，且这4篇论文都被接受发表。