拟南芥原生质体瞬时表达自噬蛋白的方法

文献类型： 中文期刊

第一作者： 冯兰兰

作者： 冯兰兰

作者机构：

关键词： 拟南芥;原生质体;自噬蛋白;瞬时表达;亚细胞定位;蛋白质互作

期刊名称： 商丘师范学院学报

ISSN： 1672-3600

年卷期： 2025 年 41 卷 009 期

页码： 44-48

摘要： 为建立一种利用拟南芥原生质体高效表达含荧光标签的蛋白并对蛋白功能进行研究的方法，将自噬标志蛋白ATG8与自噬调节蛋白SH3P2在拟南芥原生质体中进行表达以观察其二者的亚细胞定位以及是否相互作用.首先，采用1%的纤维素酶(Cellulase)、0.05%的果胶酶(Pectinase)以及0.2%崩溃酶(Driselase)酶解拟南芥悬浮细胞3h,将其制备成拟南芥原生质体.其次，根据GenBank序列，设计合成ATG8和SH3P2基因，将以上两个基因分别克隆入植物表达载体pBI221-Gene-GFP和pBI221-Gene-RFP,并转化入大肠杆菌E.coli进行扩繁和质粒提取.最后，利用电转仪将携带有荧光标签的蛋白基因的质粒转入拟南芥原生质体，加入培养基，培养16 h之后，利用激光共聚焦显微镜进行检测，同时，可以将成功表达的蛋白质进行提取以进行蛋白质互作的验证.结果显示，拟南芥原生质体成功表达两个带荧光标签的自噬蛋白.激光共聚焦显微镜观察到两个自噬蛋白能发出绿色荧光和红色荧光.免疫共沉淀结果显示两个荧光蛋白成功表达并能相互作用.综上所述，利用拟南芥原生质体表达带荧光标签的自噬蛋白，能做到表达效率高，蛋白易提取，同时方便对未知蛋白进行亚细胞定位和蛋白质互作验证.

分类号： Q943.2

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