慢病毒介导稳定表达Cas9蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证

文献类型： 中文期刊

第一作者： 李晓娇

作者： 李晓娇;朱新宇;邹娴;严霞;何燕华;罗成龙

作者机构：

关键词： 稳定表达;慢病毒;CRISPR/Cas9;SSA修复;载体构建;DF-1

期刊名称： 广东农业科学

ISSN： 1004-874X

年卷期： 2023 年 002 期

页码： 125-135

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】筛选稳定表达Cas9蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1），并基于单链退火修复机制（Single Strand Annealing, SSA）的报告载体系统，检测DF-1细胞系中的Cas9核酸酶活性。【方法】将携带Cas9蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染293T细胞包装慢病毒，收集慢病毒Cas9上清液感染DF-1细胞，经抗生素筛选得到稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞，分别用PCR和Western blot验证阳性DF-1细胞表达Cas9蛋白的情况；选择鸡卵清白蛋白（OVA）基因的sgRNA序列，将sgRNA退火产物克隆至pYP152构建sgRNA表达载体，并在sgRNA靶位点两端设计引物扩增OVA基因靶片段，将靶片段克隆至报告载体pCMV-SSA-mCherry-HindⅢ，以破坏mCherry蛋白的表达，之后再将sgRNA表达载体与SSA报告载体共同转染稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞，最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对mCherry蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到27株稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系，采用PCR扩增稳转细胞基因组，结果显示这些细胞具有Cas9蛋白基因序列，Western blots试验结果显示上述稳转细胞株均表达Cas9蛋白；sgRNA表达载体与mCherry-SSA报告载体共转后，通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中mCherry蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系，可为后续在稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。

分类号： S831%Q78

  • 相关文献

[1]稳定表达3种猪腹泻病毒嵌合抗原的CHO细胞系构建与鉴定. 宋旭,赵永祥,范宝超,郭容利,李基棕,刘静,李彬. 2023

[2]稳定表达PDCoV-S和RBD蛋白的293T细胞系构建与免疫原性评价. 肖丽,赵淑庆,袁雪松,范丽原,易鑫,陈琢琦,李彬,李基棕,主性. 2024

[3]慢病毒介导的稳定表达鸭干扰素-γ细胞株的构建. 陈柳,倪征,刘可姝,叶伟成,华炯钢,云涛,朱寅初,张存. 2024

[4]RAW264.7细胞MyD88基因缺失株构建. 王燕,陈为,董明鑫,孙成彪,张剑旭,常影,刘文森,许娜. 2022

[5]CRISPR-Cas9技术敲除甜瓜eIF4E基因表达载体的构建. 杨晶,王旭辉,王东,李冠. 2018

[6]腺病毒介导的人端粒酶反转录酶牙周膜细胞系的建立. 孙贵军,秦晓东,王世琴,胡慧珍,陆笑颜,金佳佳,吴生荣,何祥一. 2019

[7]GUA基因在梨转化植株中的稳定表达. 孙清荣,孙洪雁,赵衍,HAMMOND Rosemarie,DAVIS Robert. 2008

[8]稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的MDBK细胞系的建立. 杨侃侃,张成,王元红,殷冬冬,俞赵荣,刘光清,朱杰,李刚,赵长城,李永东,王勇. 2018

[9]牛朊蛋白在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达. 丁耀忠,张杰,刘永生,陈豪泰,曾巧英,马丽娜,马艳平,杨生海,殷宏. 2009

[10]猪流行性腹泻病毒S蛋白外分泌信号肽筛选及稳定表达细胞系的构建. 王传红,宋旭,刘诗雨,张格格,徐红,王祎,赵永祥,郭荣利,范宝超,胡朝阳,李彬. 2024

[11]稳定表达甲型流感病毒M1蛋白的MDCK细胞系的建立. 张旭,滕巧泱,周洁文,徐大伟,颜丕熙,姬希文,闫丽萍,戴晓光,张树梅,王洪斌,李泽君. 2011

[12]稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163的HEK293细胞系的建立. 牛军伟,郭龙军,谷伟红,黄明明,李忍,骆晓蕾,王玉娥. 2015

[13]稳定表达兔出血症病毒VPg蛋白RK-13细胞系的构建. 朱杰,谭永贵,郭慧敏,缪秋红,孟春春,李传峰,陈宗艳,刘光清. 2015

[14]表达PRRSV N蛋白稳定细胞系的构建与鉴定. 付宁宁,肖长广,陈梦莉,邱亚峰,李宗杰,李蓓蓓,刘珂,邵东华,马志永,魏建超. 2023

[15]鼠IFN-λ2 CHO细胞系建立及生物学活性的研究. 严玉兰,袁利学,刘洋,曹文雁,步雪峰,步志高,郑金旭. 2010

[16]稳定表达流感病毒PR8 HA蛋白MDCK细胞系的建立及鉴定. 黄海碧,滕巧泱,王朝霞,戴晓光,张树梅,张旭,申之义,李泽君. 2010

[17]稳定表达ATP5a细胞系的建立. 闫浩鑫,李明蔚,吴洋,郭龙军,冯力. 2024

[18]稳定表达流感病毒PR8HA蛋白MDCK细胞系的建立及鉴定. 黄海碧,滕巧泱,王朝霞,戴晓光,张树梅,张旭,申之义,李泽君. 2010

[19]反向PCR鉴定piggyBac介导的哺乳动物细胞转基因研究. 郝碧芳,王猛. 2011

[20]逆转录病毒载体介导的T7RNA聚合酶在猪源细胞PK15及SK6中的稳定表达. 吴锦艳,田宏,郑海学,陈妍,靳野,尚佑军,刘湘涛. 2011

作者其他论文 更多>>

微信小程序