敲除CRFK细胞氨基肽酶N对猫传染性腹膜炎病毒复制影响的研究

文献类型： 中文期刊

第一作者： 陈晓彤

作者： 陈晓彤;郭慧娟;田进;王洪峰;史鑫琪;陈洪岩;夏长友;王金泉;孟庆文

作者机构：

关键词： 氨基肽酶N;猫传染性腹膜炎病毒;猫肾细胞

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2024 年 003 期

页码： 306-313

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 猫氨基肽酶N（fAPN）参与猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）的感染过程，为研究f APN对FIPV复制的影响，本研究针对f APN第14外显子设计了1对sg RNA，将sg RNA退火后克隆至p X458质粒中，构建同时含有Cas9蛋白和sg RNA的重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定正确后，瞬时转染猫肾细胞（CRFK）中，24 h后通过流式细胞仪分选带有绿色荧光的单克隆细胞。单克隆细胞经稳定传代培养后，细胞中的绿色荧光消失，对细胞进行PCR和测序，结果显示：3株单克隆细胞在f APN第14外显子有1个碱基的插入，造成移码突变，导致f APN不能正常表达，表明敲除f APN蛋白的CRFK细胞系正确构建，命名为KO-APN14。将FIPV分别感染CRFK细胞及培养20代的KO-APN14细胞，48 h后通过间接免疫荧光试验（IFA）检测FIPV N蛋白的表达；将FIPV分别感染CRFK细胞及KO-APN14细胞，在感染4 h、12 h、24 h、36 h时采用RT-q PCR分别检测FIPV N基因、视黄酸（维甲酸）诱导基因I（RIG-I）、黑色素瘤分化相关基因5 （MDA5）、Toll样受体3 （TLR3）、干扰素β （IFN-β）、肿瘤坏死因子α （TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）的转录水平。IFA结果显示：感染FIPV的CRFK细胞出现绿色荧光，未感染FIPV的CRFK细胞、未感染FIPV的KO-APN14细胞及感染FIPV的KO-APN14细胞均无绿色荧光；RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后病毒N基因的转录水平，结果显示：与感染FIPV的CRFK细胞相比，感染FIPV的KO-APN14细胞能够极显著抑制FIPV N基因的转录（P＜0.0001）;RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后上述各细胞因子的转录水平，结果显示：与感染FIPV的CRFK细胞相比，感染FIPV的KO-APN14细胞能够抑制RIG-I、MDA5、TLR3、IFN-β、IL-6、IL-10、TNF-α及f APN的转录。综上所述，f APN是FIPV在侵入细胞及病毒复制过程中发挥重要作用，并在FIPV引起的炎症反应过程中起关键作用。本研究为f APN在免疫炎症反应中作用的研究提供科学依据，并为培育基因编辑抗病育种猫奠定实验基础。

分类号： S852.65

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