枸杞木糖异构酶基因LbxylA的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

文献类型： 中文期刊

第一作者： 赵建华

作者： 赵建华;李浩霞;尹跃;王亚军;李彦龙;樊云芳;安巍;曹有龙

作者机构：

关键词： 枸杞;木糖异构酶;原核表达;多克隆抗体;Western blot检测

期刊名称： 食品科学

ISSN： 1002-6630

年卷期： 2019 年 010 期

页码：

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 以'宁杞1号'枸杞果实为材料,利用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术,克隆出枸杞木糖异构酶基因(Lycium barbarum Linn. xylose isomerase,LbxylA)的全长,开放阅读框为1 446 bp,编码481个氨基酸,蛋白质分子质量为53.54 kDa,理论等电点5.37;对其进行生物信息学分析,发现LbxylA与烟草和马铃薯的木糖异构酶基因序列相似性较高,达到95%;构建重组质粒pGEX4T-1-LbxylA,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行原核表达,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactoside,IPTG)诱导培养,筛选出重组蛋白的适宜表达条件为:在18℃条件下100 μmol/L IPTG诱导10 h蛋白量最大,该蛋白为融合表达的且部分可溶;进一步纯化该蛋白并将获到的LbxylA融合蛋白为抗原,以日本大耳兔免疫制备Lbxyl A多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定法,测定抗体血清的效价高于1∶81 000;随着果实的发育,果实中LbxylA的相对表达量呈现逐渐下降的趋势,且在开花后9 d果实中LbxylA表达丰度最高;利用Western blot检测到LbxylA蛋白的变化与LbxylA相对表达量基本一致,但在开花后9 d果实中蛋白表达量低于开花后15 d,随后逐渐降低,果实成熟时两者的表达量到达最低.这表明枸杞果实发育前期LbxylA蛋白由于翻译后加工可能导致蛋白质表达滞后于基因,其结果有助于进一步研究LbxylA功能及其对果实糖积累的作用.

分类号： S567.19

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