禽痘病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

文献类型： 中文期刊

第一作者： 叶伟成

作者： 叶伟成;陈柳;倪征;云涛;华炯钢;霍苏馨;付媛;张存;朱寅初

作者机构：

关键词： 禽痘病毒;SYBR Green Ⅰ;荧光定量PCR;临床检测

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2025 年 47 卷 008 期

页码： 813-819

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为建立禽痘病毒(APV)快速灵敏的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增鸡痘病毒(FPV,APV中的主要病毒)高度保守核心基因P4b,构建重组质粒标准品pMD19-FPV-P4b,经PCR与测序鉴定正确后作为模板,采用设计的qPCR通用型引物FPV-JC-F/R(根据分析比对不同种属27种APV A分支高度保守的核心基因P4b设计),利用方阵法优化各反应条件,初步建立检测APV的qPCR方法.将重组质粒pDM19-FPV-P4b 10倍倍比稀释后作为模板,利用优化的反应条件经qPCR扩增,以拷贝数的对数值为纵坐标,Ct值为横坐标绘制标准曲线,结果显示,标准曲线的R2为0.9995,质粒标准品在3.53拷贝/μL~3.53×108 拷贝/μL范围内与各自的Ct值呈良好的线性关系.采用建立的qPCR方法检测APV及禽类常见病毒,评估其特异性;采用该qPCR和常规PCR方法分别检测10倍倍比稀释的FPV弱毒疫苗(9.75×106 TCID50/mL~9.75×10-1 TCID50/mL)及质粒标准品(3.53×107 拷贝/μL~3.53 拷贝/μL),评估该方法的敏感性;以不同浓度的质粒标准品作为模板,于同一时间和不同时间分别利用该qPCR方法检测,评估该方法的重复性.结果显示,除FPV与鸽痘病毒(PPV)检测结果为阳性外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽腺病毒4型(FAdV-4)、火鸡疱疹病毒(HVT)等均为阴性结果,特异性强;该方法对FPV弱毒疫苗与质粒标准品的检测限分别为9.75 TCID50/mL和 3.53 拷贝/μL,常规PCR对FPV弱毒疫苗和质粒标准品的检测限分别为975 TCID50/mL和3.53×102 拷贝/μL,组内组间重复性试验的变异系数均小于1.57%,重复性好.采用该方法和常规PCR方法同时检测186份临床疑似患鸡痘鸡的病料样品(鸡咽喉部痘疱结节、痘痂样品41份;肺、肝、肾脏样品各32份;咽拭子样品49份),结果显示,qPCR的阳性检出率为65.1%(121/186),常规PCR的阳性检出率为55.9%(104/186),二者检测结果的阳性符合率、阴性符合率与总符合率分别为100%、79.3%(65/82)与90.9%(169/186).综上,本研究建立的检测APV的qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好、适用范围更广,可以用于临床各种样品的快速检测,为APV的临床检测和流行病学调查提供了一种便捷的新的技术手段.

分类号： S852.65

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