坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立与应用

文献类型： 中文期刊

第一作者： 唐晟

作者： 唐晟;马瑶;冯贺龙;李丽;汪宏才;张蓉蓉;曾哲;姚伦;温国元;邵华斌;罗青平;曾驰;谢佳燕;商雨

作者机构：

关键词： 坦布苏病毒;E蛋白;原核表达;间接ELISA;抗体

期刊名称： 黑龙江畜牧兽医

ISSN： 1004-7034

年卷期： 2024 年 016 期

页码： 54-61,116

收录情况： 北大核心

摘要： 为了大量表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并建立一种可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，试验首先将去除跨膜域的截短坦布苏病毒E基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，用IPTG诱导表达重组蛋白，利用His标签对表达的重组蛋白进行纯化；然后以重组蛋白为包被抗原、鸭待测血清为一抗、HRP标记兔抗鸭IgG为二抗，通过反应条件[抗原包被质量浓度、抗原包被条件、封闭液、封闭时间、一抗(待测血清样品)稀释液、一抗(待测血清样品)稀释度、一抗(待测血清样品)孵育条件、二抗稀释度、二抗孵育条件和显色条件]的优化和临界值的确定建立间接ELISA方法；最后进行特异性、敏感性和重复性试验，并通过临床样品检测比较该方法与Western-blot方法的符合性。结果表明：PCR扩增得到大小为1 227 bp的坦布苏病毒截短E基因，经双酶切与测序验证后，成功构建重组表达质粒pET28a-E-tr。诱导后的重组蛋白分子量大小为49 ku并以包涵体的形式表达，纯化后的重组蛋白条带单一，可与鸭源坦布苏病毒阳性血清发生特异性结合。建立的ELISA方法优化后的抗原包被质量浓度为5μg/mL,抗原包被条件为4℃过夜，封闭液为2%BSA,封闭时间为60 min,一抗(待测血清样品)稀释液为1%BSA,一抗(待测血清样品)稀释度为1∶800,一抗(待测血清样品)孵育条件为37℃、30 min,二抗稀释度为1∶7 500,二抗孵育条件为37℃、90 min,显色条件为37℃、10 min,阴阳临界值为0.368;仅可检测出鸭源坦布苏病毒阳性血清，无法检测出鸭源鸭疫里默氏杆菌、新城疫病毒、禽腺病毒、禽流感病毒、细小病毒阳性血清；待测血清最高稀释度为1∶3 200(Western-blot方法待测血清最高稀释度仅为1∶1 600);批次内重复变异系数(CV)为1.7%～4.7%,批次间重复CV为1.4%～5.7%;对137份临床鸭血清样品进行检测，阳性率为81.7%,与Western-blot方法比较样品阳性率较高，两种方法的符合率为87.6%。说明成功表达了坦布苏病毒截短E蛋白，并建立了一种特异性良好、敏感性较高、重复性较好的可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。

分类号： S852.65

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