鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白原核表达及多克隆抗体制备

文献类型： 中文期刊

第一作者： 毕可然

作者： 毕可然;李银;韩凯凯;赵冬敏;刘青涛;刘宇卓;黄欣梅;杨婧

作者机构：

关键词： 鸭寡腺苷酸合成酶;原核表达;多克隆抗体

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2019 年 52 卷 23 期

页码： 4429-4436

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】已有研究获得鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白(oligoadenylate synthase-like protein,OASL)基因全长,并且证明其可以抑制鸭坦布苏病毒复制。因此在通过原核表达和多克隆抗体制备技术获得带有GST标签的鸭寡腺苷酸合成酶样融合蛋白和该融合蛋白的特异性抗体,为进一步明确鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白抑制病毒复制分子机制提供物质基础。【方法】根据前期研究已经获得的鸭OASL基因开放阅读框(open reading frame,ORF)序列设计全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R。利用动物组织总RNA提取试剂盒提取健康樱桃谷鸭幼鸭脾脏总RNA;通过RT-PCR,利用随机引物和M-MLV反转录酶扩增获得鸭脾脏cDNA,以cDNA为模板,利用设计合成的pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R引物进行PCR扩增,扩增后的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测后将片段大小与目的条带大小相同的PCR产物切胶纯化,纯化后的产物克隆到pEASY-T1载体,挑取单克隆菌落送基因公司测序,测序验证正确的PCR纯化产物通过限制性内切酶Bam H I和Xho I酶切连接至带GST标签的原核表达载体pGEX-4t-1。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(PLYSS)~(TM),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导表达4 h后检测该融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白的表达。利用GST柱亲和纯化上清中的可溶性融合蛋白,经20 mmol·L~(-1) Tris-HCL和0.10 mol·L~(-1)NaCL溶液透析后获取纯化的融合蛋白,采用SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白。采用皮下多点注射方法免疫新西兰白兔,经3次免疫后制备多克隆抗血清,采用SDS-PAGE和间接免疫荧光检测抗体的纯度和效价。【结果】克隆测序结果表明,设计合成的鸭OASL基因全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R能够从樱桃谷鸭脾脏中获得鸭OASL基因ORF序列,并且序列组成与前期研究结果一致。被扩增的序列经酶切后,鸭OASL基因能够与pGEX-4t-1载体成功连接,IPTG诱导后可以在大肠杆菌BL21(PLYSS)TM中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,融合蛋白大小约为84 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。经GST亲和层析纯化上清中的可溶性鸭OASL融合蛋白,得到0.5 mmol·L~(-1)纯度抗原蛋白。经3轮免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,纯化后ELISA结果显示鸭OASL蛋白抗体具有较好的灵敏度,最高效价为1:512 000,SDS-PAGE结果显示抗体大小为55 kD,与ORF理论值相同,且抗体纯度为90%以上。【结论】设计合成的引物能够成功地获得鸭脾脏OASL基因ORF序列,该ORF能够在原核细胞中成功表达,表达的融合蛋白通过免疫新西兰兔能够获得高纯度和高效价的鸭OASL多克隆抗体,研究成果为后续深入研究鸭OASL蛋白抑制病毒复制分子机制奠定坚实的物质基础。

分类号： S852.65

  • 相关文献

[1]Carboxin抗性基因(Cbx~R)原核表达及多克隆抗体的制备. 李小宇,张正坤,王秋华,张春雨,张淋淋. 2015

[2]猪CD40L基因的原核表达及特异性多克隆抗体制备. 薛刚,祝长青,郑其升,张雪花,李倬,侯继波. 2011

[3]延边白鹅IFN-α基因的原核表达及其表达产物生物学活性的研究. 彭永刚,陈海迪,高旭,张颖,鲁承. 2014

[4]绵羊肌肉抑制素C-端的表达、纯化及多克隆抗体的制备. 马毅,舒建洪,李晴,关宏,安晓荣,陈永福. 2009

[5]新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备. 毕庄莉,朱英奇,陈宗艳,李传峰,孟春春,王桂军,刘光清. 2014

[6]Asial型口蹄疫病毒分离株P1基因的原核表达及其多克隆抗体的制备. 张中旺,张永光,王永录,潘丽,张昱. 2009

[7]小麦热激蛋白WHSP90基因的原核表达及多克隆抗体制备. 李琳,徐兆师,刘丽,于卓,李连城,陈明,马有志. 2009

[8]鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备. 陈明,徐幸莲,周光宏,汤晓艳,袁飞,陈爱亮. 2013

[9]桑树几丁质酶基因Machi1的克隆及原核表达. 肖圣燕,朱峰,冉瑞法,李镇刚,张永红,邵榆岚,唐芬芬,白兴荣. 2019

[10]西藏株小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备. 于瑞嵩,高位相,李凤平,董世娟,李震. 2018

[11]利用hAPOA1原核蛋白生产兔多克隆抗体. 徐志伟,赵杰,刘伟忠,刘照亭,王期. 2016

[12]猪NLRP3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备. 张艳,王文秀,刘海隆,曹宗喜,谭树义. 2019

[13]一个植物半胱氨酸蛋白酶多克隆抗体的制备及其应用. 彭琪琪,羊健,廖乾生,张恒木. 2018

[14]灰飞虱内生病毒HiPV外壳蛋白VP1多克隆抗体的制备及在病毒检测中的应用. 朴君,许春玲,朴敬爱,周益军,李硕. 2019

[15]猪源Viperin基因的克隆、原核表达以及抗体的制备. 方剑玉,朱文豪,李海利,郭小参,白献晓,王克领. 2018

[16]琥珀蚕丝腺转录因子基因AaSGF-1的克隆、原核表达及组织表达分析. 李琼艳,陈安利,荀利杰,刘增虎,廖鹏飞,杨伟克,董占鹏. 2021

[17]口蹄疫病毒3B蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备. 辛旭,吴香菊,齐静,王永志,李相安,杜正国,单虎,杜以军. 2021

[18]山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的表达及其多克隆抗体的制备和特性分析. 江锦秀,张靖鹏,林裕胜,游伟,胡奇林. 2021

[19]二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备. 田彩红,刘晓光,黄建荣,王瑛,封洪强. 2020

[20]莱茵衣藻BBS1蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备. 刘雁霞,刘思佳,王慧,黄梦倩,王岩,樊振川. 2019

作者其他论文 更多>>

微信小程序