文献类型： 中文期刊

第一作者： 刘庆忠

作者： 刘庆忠

作者机构：

期刊名称： 落叶果树

ISSN： 1002-2910

年卷期： 1989 年 04 期

页码： 31-33+29

摘要： 大多数果树植株,由于经过长期的无性繁殖,都不同程度地受到病毒的侵染。在目前条件下,防治病毒病最根本的措施,是栽种无病毒的果树苗木,而培育无病苗的最大障碍是病毒的检测和鉴定。 在果树上常用的诊断病毒方法是指示植物法,但这种方法需要时间长(草本数月以上,木本1年以上),同时还需要同室、温室等设施,因此繁琐而不经济。其他血清学方法、免疫电镜法、荧光抗体法、酶联免疫吸附法虽较快速简便,但这对于受病毒系统和混合侵染的木本果树来说,纯化病毒和制备抗血清往往难于完成。这些方法另一缺陷是仅能检测具有蛋白质外壳的病毒,而对无蛋白质外壳的类病毒却无能为力。近年来已证明,用双链核糖核酸( ds RNA)分析法诊断果树的病毒病具有快速、灵敏、简便等优点[5]。采用该法,在对果树病毒特性一无所知的条件下,也可有效地检测已知和未知的病毒,并且不受寄主和组织的影响。实践中,一个操作熟练的技术人员在48小时之内就能完成整个过程,每周可检测 100个样品。一、 ds RNA分析法检测果树清霉 的原理 (一)果树病毒和类病毒核酸是核糖核酸(RNA),在对病毒的复制研究中发现,其复制过程是以单链 RNA( SS R NA)为模板合成双链 R NA( ds R NA)。ds RNA也叫复制型RNA(简称RF).它对RNA氧化酶具有抗性,其大小是SSRNA的两倍。除了ds RNA和SSRNA外,在侵染细胞里还发现第三种RNA,它介于前两者之间,称为复制中间型RN A(m),这种结构是R*A单链和双链的复合物,其单链部分稳定性差,遏RNA酶就水解,最终也变成dSRNA。从以上分析可以看出,只要果树体内存在病毒或类病毒,就存在dsRNA;而未受其侵染的植株不含有这种高分子量的dSRNA的同源片断。 在感病植株中,除了主要的复制型dSRNA外,也检测到一些较小的dSRNA分子,称其为亚基因组dSRNA。已证明对于给定的病毒或类病毒组,其基因组和亚基因组的dSRNA的种类、图型具有一致性。因此,只要通过凝胶电泳分析,检测 d S RN A的数目、大小,就可以确定未知病毒属于哪一类群。 (二)由于在样品提取过程中,加入了有机溶剂蛋白质变性剂,因此,核酸提取分离能否成功与寄主组织无关。 (三)就目前所知,植物病毒RN A的分子量介于0.4X 10’一15.5X10’之间。因此,可以推测,受RV!八病毒或类病毒侵染的果树植株,其ds RNA同源片断的分子量均大于0.IX 10’。在检测过程中发现,某些植物体中也存在异源的小分子量的dSRNA,但由于这些小分子量的分子(远小于0.IX 10’)通常被电泳到凝胶的末端,它们的存在并不影响依电凝电泳为基础检测 ds RNA的结果。 二、方法和步骤 (一) dSRNA的提取 选取新鲜的组织样品 10—40 g(柱分析法)或0.1—0.sg(微量法),研成粉末,将其分别转移到已冷冻的50—250ml的离心瓶中(柱分析法)或3 ml的离心管中(微量法)。然后立即加入 l— 5倍体积的双强 S T E(单强一0. IM NCCI,0.05MTrisHCI,IMEDTA,PH7.0),0.1—0.5%的a一疏基乙醇,0.sing/ml碎皂土(或者1%的PVP)进行提取。组织一融解,就加入等体积的S*E饱和苯酚(用NH。OH调整PH到7.0)和0.5体积的氯仿一异戊像混合液(24/1—V/V)提取这个泥浆,在冰块上振荡半小时,悬浮液采用离心澄清,将水相调整后含乙.醇15—18锯( V/ V)。 (二) ds RNA的分离和浓缩 1.标准柱法取上清液,在 CF—11纤维柱上纯化。层析柱含CF—11纤维素2.sg,载有溶于含15—18%乙醇的单强STE20—40。l的样品。用80—120ml含有15—18q0乙醇的单强S’fE冲洗该柱。用14ml的单强STE从柱中洗脱dsRNA。在样品中加入乙醇和醋酸钠,使其浓度分别达到67 yo和50。1-M,从而使dSRNA浓缩沉淀,最后在一20“ C将其贮存4/J’时以上。 2.微量法将含15—18qo乙醇的单强STE平衡的50mgCF一11纤维素转移到1.5 ml的微离心管中,然后再向管中加入按如上方法将0.l—0.sg组织制成的上清液。将微离心管在冰块上振荡三次,每次振荡5分钟,这样可使dSRNA更好地吸到纤维素上。然后离心集结纤维＄一dSRNA复合物,再向离心管中每次加 1.0 ml含15—18q0的乙醇STE,振荡离心、移注上清液,如此反复冲洗3—4次。在最后一次冲洗后,加人0. 5 ml单强S T E到纤维素吸移管中冲洗dSRNA,使dSRNA与纤维素分离。振荡、离心和转移含ds RNA的上清液到第二个微离心管中。 dSRNA用上述的乙醇沉淀法浓缩。 (三)dSRNA的检测(凝胶电泳分析) 用含10%甘油的电泳缓冲液( 40 mMTris、20mM醋酸钠、10mMEDTApH7.8)再次悬浮已离心的乙醇沉淀,然后将样品用于电泳。 ds RNA在6—8%的聚丙烯酸胺凝胶板(0.smmxscmxlocm)上分析。在常温下,30mA 100V电泳2—4小时。凝胶用10—50 mg/1的演化乙院溶液染色10分钟一(也可用AgNO。染色),在水中脱色。 在电泳前应注意如下问题:①用已知R NA分子量的病毒作为检测分子量的标记;③用健康植株上的材料作对照;③在电泳之前应将样品用10 pg/ml脱氧核糖核酸酶1或者核糖核酸酶处理,降解DNA和SS RNA等污染物。 5、快速检测dSRNA的其它方法 对于草本和木本果树上的已知和未知病毒,尽管已证明 d S R NA分析法是一种有价值的检测手段,但在样品处理和凝胶电泳分析方面比血清学方法要麻烦得多,因此不太适合大规模的检测病毒。但人们可以借助于ds RNA发展杂交技术,以便达到大规模的检测目的其具体做法如下:将提纯的dSR*A部分水解,用多核着酸激酶,将具有放射性的核管酸标记到5’端,产生特异探针,这种末端标记的探针可用于检测粗提的核酸制品。这种方法的缺点是需要约的dSRNA,而纯化ds RNA却相当麻烦.除发展杂交技术外,我们还可以借助ds RNA产生补体DNA(cDNA),使DNA克隆化(Cloning),这样无需反复提纯ds RN A就可以产生大量的探针,保证其无限的供给。用dSRNA制作C D NA有两种方法(‘、’):①用福尔马林和尿素使ds RNA变性,分离成单.链,然后在聚丙烯酸胺凝胶上电泳。 SS RNA用于制作C D NA模板,将C D NA克隆化即可。③dSRNA在二甲基亚视或者甲羟化汞中分离,然后将RN A分端多腺化,在引物存在的条件下,直接加到反转录混合物上。在补体模板上,反转录合成D NA补链。将 R NA水解,韧练D NA链将D NA链克隆化即可。 总之,不论将dsRNA作为mRNA的模板进行离体转录合成蛋白质,生产单克隆抗体,还是将d S R NA作为 C D NA模板制作杂交探针,都大大促进了快速检测果树病毒技术的发展。 四、 d S R NA分析法在果树病毒检测 上的应用举例 (一)检测和诊断已知病毒 dSRNA分析法自1976年首次用于检测植物病毒以来,进展迅速。具不完全统计,有关这方面的论文已达百余篇,已对100余种植物病毒WJdS’R NA进行了分析,其中果树病毒达20余种,其寄主分别为油梨(‘、‘、’〕、柑桔(‘)、樱桃〔’)、木每(’、‘)、醋粟(“)、草每(’)、苹果(‘、“)。并且该种方法已用来作为油梨的主要病毒、甜樱桃小果病和坏死锈斑病病毒以及木等叶斑病毒的诊断手段。 (二)检测未知病毒 现举一例说明,在美国加州研究油梨黑条斑病(avocado bleakstre,aM的致病病原中,研究者分析了10D0余株树的提取液中的ds RNA,发现有某些从未所知的病毒普遍存在于油梨树上,仅有16qo的树不含这些可检测到的dSRNA依组织的类型,品种和来源不同,可检测到三种类型的 ds RNA。他们有的单独存在,也有的彼此结合存在。这样的d s R NA在病树上和相对健康的树上均有。尽管这三种病毒在油梨的病理学和与其它病毒的亲和检方面尚未所知,但研究者却能大胆地预言有三种不同的病毒或类病毒普遍存在于油梨树体内。他们在其对病毒特性一无所知的条件下,又依据特异ds RNA分析技术,对这三种病毒的某些生物学特性进行研究,确定上述三种病毒均可种传,其种传率可达60—100gro。其中有两种病毒可嫁接传播。日本也采用d S R NA分析法从感染苹果锈果病植株中提取到ds RNA,并与其它方法相结合,经分析确定苹果锈果病为类病毒侵染所致(‘)。诊断果树病毒的新方法——dsRNA分析法@刘庆忠$山东省果树研究所[1]龙刁才(译),小金泽硕城(著)农业新技术新方法译丛1987(4) [2]Dodds T.A.and Joseph B.MPhytopathology1983 73:419-423 [3] Jones A.T et al ActaHorticultureae 1986 186:63-70 [4] Jorder R. L et al Phytopathology 1983, 73: 791 [5]Jorder R. Let al ActaHortuclturae 1985 164:101-108 [6] Jordan R. L et al Phytopathology 1983 73:1130-1153 [7] Jordan R.L et al Phy topathology 1983; 73: 97 [8] Legrand G, and Yerhouen M.Acta Horticulturae 1986193:283-290 [9] Rober R.Martin Hortsci-enle 1985 20 (5): 837-845 [10] Rosuer A.et al Phyto- Pathology 1983, 73: 69-702

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