柑橘鳞皮病毒基因组全长cDNA克隆构建及其侵染性鉴定

文献类型： 中文期刊

第一作者： 李娅毓

作者： 李娅毓;王新亮;周金环;李楚欣;李佳欣;田旭斌;宋震

作者机构：

关键词： 柑橘鳞皮病毒;全长cDNA克隆;农杆菌介导接种;侵染性鉴定;柑橘病毒

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2025 年 58 卷 017 期

页码： 3451-3460

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】柑橘鳞皮病毒（citrus psorosis virus,CPsV）是蛇形病毒科（Aspiviridae）蛇形病毒属（Ophiovirus）的一种三分体负义单链RNA病毒，可引起柑橘树干开裂流胶，甚至整株死亡，严重威胁柑橘产业安全。负链RNA病毒的反向遗传学体系构建具有挑战性，本研究旨在建立CPsV基因组的全长cDNA克隆，并鉴定其侵染性，为其致病机理等研究打下基础。【方法】利用软件Primer 5设计引物，以CPsV侵染植株总核酸为模板，分别进行CPsV 3条链RNA1、RNA2、RNA3的RT-PCR扩增。基于双元表达载体pXT1，通过In-Fusion同源重组技术分别构建3条RNA链的cDNA克隆，进行酶切验证并测序分析。利用本氏烟（Nicotiana benthamiana）接种体系筛选CPsV 3条链的cDNA克隆组合，并进一步通过农杆菌介导注射接种至草本寄主千日红（Gomphrena globosa），真空浸润接种至不同的柑橘品种，观察其症状并进行分子检测。【结果】分别获得CPsV RNA1全长cDNA克隆2个，RNA2全长cDNA克隆2个，RNA3全长cDNA克隆2个。随机选取RNA1、RNA2、RNA3全长cDNA克隆各一个进行组合，作为CPsV基因组全长cDNA克隆，通过农杆菌介导注射接种本氏烟并进行RT-PCR检测。结果表明8个组合中CPsV-122阳性率最高，为62.50%。核苷酸序列分析显示，CPsV-122与西班牙分离物P-121的序列一致性最高，其RNA1、RNA2及RNA3相应的序列一致性分别为98.06%、97.10%和99.32%。在基于外壳蛋白氨基酸序列构建的系统进化树上，CPsV-122与P-121聚在同一支，并与来自中国、突尼斯、意大利的5个分离株聚为一簇。通过农杆菌介导接种CPsV-122至草本寄主千日红及柑橘品种尤力克柠檬（Citrus limon）和邓肯葡萄柚（C. paradise），进行症状观察和RT-PCR检测。结果表明，7 dpi时，千日红阳性率为16.67%(2/12)，在25 dpi时，阳性植株出现明显的红褐色枯斑、叶片局部坏死等CPsV侵染症状；邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的RT-PCR检测结果除阳性对照外均呈阴性，但在90 dpi,CPsV-122接种的20株尤力克柠檬植株中有13株表现出明显的矮化、黄化和嫩梢充胶、枯死等CPsV侵染典型症状，而空载对照组和健康对照组均未观察到特异性症状。【结论】CPsV-122为CPsV基因组全长cDNA克隆，能够系统侵染千日红并在柑橘上引起植株矮化和嫩梢枯死等CPsV侵染典型症状。

分类号： S436.66

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