文献类型： 中文期刊

第一作者： 常万存

作者： 常万存;仲跻峰;宋杰;窦忠英;马鸿飞

作者机构：

期刊名称： 农业生物技术学报

ISSN： 1006-1304

年卷期： 1999 年 7 卷 02 期

页码： 140-162

收录情况： CSCD

摘要： 哺乳动物ES细胞的分离与克隆，从一开始就与小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）紧密地联系在一起（Evanse和Kaufman，1981）。Meinecke－Tillmann（1996）、尚克刚（1994）等认为，来源不同的成纤维细胞对ES细胞分离效果又有一定影响。本研究利用妊娠终止胚胎，参照前人在小鼠及其它动物上的经验，探讨了人胚胎成纤维细胞（HumanEmbryonicFibroblast，hEF）的分离培养方法，并用以制作饲养层而分离小鼠ES细胞，目的是为哺乳动物ES细胞研究提供试验材料和科学依据。1材料和方法本研究所用废弃胚胎村料由妇产科医生收集提供。用无钙镁PBS（简称PBS（-））浸洗。取生殖峪／腺及其周围组织，置于培养皿中剪碎，加入等体积的蛋白酶／EDTA消化液处理15～30min，收集细胞悬液。然后按1～2×104／cm2的密度转移到培养皿中，置于CO2培养箱（37．5℃，5％CO2，饱和湿度）。24h后更换培养液。此后每48h更换1次培养液。原代hEF可用于继代培养，也可用于饲养层制作而种植小鼠囊胚，或者持续观察hEF在体外培养期间的生存寿命。制作饲养层时，用丝裂霉素C处理2～2．5h。细胞密度以5×104／cm2为宜。24h后可放入交配后3．5d的小鼠囊胚，观察贴壁和ICM增殖情况。4～6d后对增殖的ICM及其所形成的类ES细胞集落进行传代。挑取充分增殖的ICM和ES细胞克隆，用消化液处理，吹打使之成为单个细胞或小细胞团，然后转移到新制备的饲养层上。胚胎贴壁率、ICM增殖率借助软件，以0．05和0．01两个概率水准统计其差异显著性。2试验结果2．1胚胎采集与处理本研究共采集到8枚可用胚胎，胚龄21～210d，顶臀长30～210mm。在25℃或37℃消化10～30min。2．2细胞形态胚胎组织经消化解聚之后，hEF细胞呈球形。培养12～24h之后逐渐长出纤维而呈梭形。此后随着纤维的进一步伸长而呈长校形、条形。与相同培养期的MEF相比，hEF稍显钝圆，并且能形成漩涡状、栅栏状或放射状的有序排列。继代培养至13代以后观察到了细胞老化现象，hEF纤维数目增多、纤维分叉，胞体呈不规则形的薄片状。2．3细胞贴壁与增殖原代培养6hhEF开始贴壁，12h之后细胞贴壁率为30W50％。贴壁之后即长出纤维。24h更换培养液，细胞碎片和悬浮的死细胞被清除，培养液变清亮。细胞生长速度逐渐加快。48h后细胞数量和密度增大，说明已有细胞完成第一次有丝分裂。4～10d之后细胞长满皿底而连生。2．4继代培养来自3枚胚胎（3、5、6号）组织的hEF在体外培养条件下生长旺盛，分别于第twlo天进行首次传代。3号胚胎继代培养至第6代，5、6号胚至第14代之后，人为终止实验。2．5原代hEF的持续培养原代培养的5号胚hEF在不断更换培养液的前提下，持续培养至第24天，细胞集落保持正常。25d之后皿底局部细胞凝集成团。第43d时凝集百积约为15％，然而没有观察到如同MEF那样的细胞卷层现象。2．6小鼠胚胎在hEF饲养层上的贴壁与生长将5、6号胚的hEF用于制作饲养层，移入交配后3．5d的小鼠囊胚115枚，其中原代细胞上sl枚，第10代细胞上64枚。胚胎在hEF饲养层上发育良好，形态正常，于24h之后脱去透明带，48h后各有48和56枚完成贴壁，贴壁率分别为94．1O和87．5O，差异不显著（P＞0．05）。第2～3天ICM开始增殖，第4d全部推开饲养层细胞而呈岛屿状。至第5天90．1O（82／91）的胚胎ICM出现程度不同的增殖，面积增大5－10倍，并长成柱状、蘑菇云状结构。原代和第10代hEF上ICM增殖率差异不显著（p0．0引。2．7类ES细胞的培养挖取第5天的小鼠ICM细胞，消化解聚之后种植到新的hEF饲养层上，3d后观察到7处类ES细胞集落。3分析与讨论本研究利用附殖后胚胎分离培养hEF细胞，在8枚胚胎中取得成功。以ES细胞培养为目的分离和克隆hEF，继代培养至第14代，并且用小鼠囊胚共同培养法加以检测，这在国内外尚未见报道。小鼠ICM在hEF细胞饲养层上能正常发育并分离出ESi田胞，说明hEF具有与MEF及其他动物成纤维细胞相似的生长因子分泌特性，是制作饲养层的又一理想资源。本研究胚胎贴壁率和ICM增殖率与钱永胜、窦忠英（1996）用MEF的结果（88．6％、87．l％）基本相同，但是高于尚克刚（1993）在C57BL／6（75．0％、63．6％）和129（71．8％、71．8％）品系小鼠上的结果，而与其在C57BL／6129杂交品系上的结果（84．4％、sl．3％）相近。目前广泛使用的MEF饲养层容易出现崩解和翻卷现象，寿命只有10d左右。本研究发现，hEF在为期24d的体外培养中形态正常，第43天亦只有小范围的细胞凝集，说明hEF细胞用于ES细胞研究时在使用期限上是有优势的。这意味着hEF饲养层在制作时间上可能不象MEF那样要来严格，并有可能反复使用，其实践意义在于，ES细胞分离与克隆的工作量可由此得以缩减。4结论hEF可由2～6月龄的胚胎组织经胰蛋白酶／EDTA消化解聚获得，并可继代培养到14代以上，是ES细胞分离研究中理想的饲养层资源。由于其细胞寿命长，不易崩解，因而使用起来也更为方便。人胚胎成纤维细胞的分离培养与检测(简报)@常万存$山东省农科院生物技术研究中心!250100@仲跻峰$山东省农科院生物技术研究中心!250100@宋杰$山东省农科院生物技术研究中心!250100@窦忠英$西北农业大学动物医学系!712100@马鸿飞$咸阳市第三人民医院!712100国家自然科学基金

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