鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用

文献类型： 中文期刊

第一作者： 郭鹏宇

作者： 郭鹏宇;赵妍;刘胜旺

作者机构：

关键词： 鸡传染性喉气管炎病毒;gG蛋白;单克隆抗体;间接竞争ELISA

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2023 年 45 卷 007 期

页码： 704-709,728

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病.为建立检测该病毒gG蛋白的间接竞争ELISA方法,本研究以原核系统表达ILTV gG蛋白,并采用切胶纯化该重组gG蛋白(rgG)后经western blot检测纯化的rgG(P-rgG)与本研究室制备的gG蛋白单克隆抗体(MAb)3C8的反应原性.将MAb 3C8采用Protein G亲和层析柱纯化后与HRP偶联(HRP-3C8),利用间接ELISA法测定纯化HRP-3C8的效价.结果显示,P-rgG与MAb 3C8发生了特异性反应,在30 ku处出现特异性条带.纯化的HRP-3C8效价达1∶51 200.以P-rgG作为包被抗原,以纯化的HRP-3C8作为检测抗体,通过对各反应条件优化后初步建立了ILTV gG蛋白间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测方法.条件优化结果显示,P-rgG包被量为12.5 ng/孔,HRP-3C8抗体稀释度为1∶10 000,将待检样品与HRP-3C8抗体在37 ℃孵育40 min后加入ELISA板再反应20 min,TMB底物反应10 min.将待检样品的抑制率(PI)≥ 31.08%判为阳性;采用该方法分别检测ILTV、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡痘病毒(FPV),通过计算PI,评估该方法的特异性;按照Reed-Muench法测定ILTV K317株的鸡胚半数感染量(EID50),再将该病毒2倍倍比稀释(1∶10~1∶2 560)后,以该ic-ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;利用同批次和不同批次P-rgG分别包被ELISA板,采用该ic-ELISA方法检测ILTV阳性及阴性样品,评估该方法的重复性.结果显示,该方法除了能检测ILTV外,其余相关病毒均为阴性结果;将ILTV稀释至1:320时检测结果仍为阳性,相当于75 EID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%.利用该方法及荧光定量PCR(qPCR)分别检测50份临床ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、10份ILTV活疫苗,该方法检测结果显示,阳性检测率为73.3%(44/60),阴性率为26.7%(16/60).qPCR的检测结果显示,阳性检测率为81.7%(49/60),阴性率为18.3%(11/60),二者的阴、阳性符合率分别为90.9%和87.8%,总符合率为88.3%.本研究建立的ILTV gG蛋白ic-ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于检测实验室和临床ILTV感染的不同样品,为ILTV及其疫苗的检测提供了新的技术手段.

分类号： S852.65

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