基于萤火虫荧光素酶报告基因检测凋亡的系统构建及鉴定

文献类型： 中文期刊

第一作者： 车路平

作者： 车路平;栗永华;杨斌;徐智凯;廖瑛;仇旭升;谭磊;孙英杰;宋翠萍;丁铲;姚刚;王金泉;孟春春

作者机构：

关键词： 萤火虫荧光素酶;凋亡;Caspase-3

期刊名称： 生物工程学报

ISSN： 1000-3061

年卷期： 2019 年 8 期

页码： 1557-1565

摘要： 为构建一个能够快速检测凋亡的含荧光素酶报告基因(Fluc)的真核表达质粒,采用PCR的方法将Caspase-3的识别基序Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)四个氨基酸引入至Fluc基因的C端和N端之间;同时选取Asp-Glu-Val-Gly (DEVG)四个氨基酸作为阴性对照.随后重组片段分别克隆至分离型内含肽的N端和C端之间,并命名为pFluc-DEVD和pFluc-DEVG.将该表达质粒与海肾荧光素酶报告质粒(RLUC)同时转染至HeLa细胞,通过双荧光素酶报告基因和Western blotting实验检测细胞凋亡水平.双荧光素酶报告基因系统实验结果显示,当发生凋亡时,pFluc-DEVD质粒组表达的萤火虫荧光素酶的含量高出pFluc-DEVG质粒组约3倍.Western blotting检测结果显示,转染pFluc-DEVD质粒的细胞在凋亡药物刺激后,Fluc活化的蛋白显著增多,且Caspase-3的活化程度与Fluc的表达呈正相关,并有显著的统计学差异.以上结果表明,pFluc-DEVD真核表达质粒表达的萤火虫荧光素酶蛋白能被细胞内的Caspase-3酶裂解,且该质粒能够精确地反映出细胞的凋亡水平,为后续进行凋亡定量检测提供了一个可借鉴的方法.

分类号： Q78

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