RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因真核表达载体构建及生物信息学分析

文献类型： 中文期刊

第一作者： 乔连江

作者： 乔连江;陈晨;张如;崔立恒;徐丽;杨艳玲

作者机构：

关键词： RAW264.7细胞;Rhoa基因;Ptgs2基因;真核表达载体;生物信息学

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN：

年卷期： 2021 年 007 期

页码： 2313-2323

收录情况： 北大核心

摘要： 为深入研究Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family, member A,Rhoa）和环氧合酶2（cyclooxygenase 2,Ptgs2）分子在布鲁菌逃逸机体免疫中发挥的作用,试验对RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因进行扩增与克隆,构建真核表达载体并预测生物信息学功能。根据GenBank数据库中公布的RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因CDS区序列（登录号:JN971019.1和NM011198）设计引物,提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,经RT-PCR扩增Rhoa和Ptgs2片段并测序,将纯化的Rhoa和Ptgs2片段分别与线性化pcDNA3.1质粒相连接,对重组质粒进行测序分析和双酶切鉴定后,利用LipofectamineTM2000转染293T细胞,经实时荧光定量PCR和Western blotting验证Rhoa和Ptgs2基因的表达情况,并应用生物信息学软件对Rhoa和Ptgs2基因进行预测分析。结果显示,试验成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达质粒;实时荧光定量PCR检测均在转录水平上表达;Western blotting可见Ptgs2蛋白在70 ku处有一明显条带,而Rhoa蛋白未出现条带。生物信息学预测显示,Rhoa和Ptgs2基因核苷酸序列相似性较高,在不同物种之间较为保守;Rhoa不具有信号肽,为不稳定蛋白,而Ptgs2在第17-18位氨基酸处存在信号肽,为稳定蛋白;Rhoa和Ptgs2蛋白分别有12和53个潜在的磷酸化位点;二级结构、三级结构均以无规则卷曲为主。本研究成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达载体,均在转录水平上表达,并分析了其生物学功能,为后续开展RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因在布鲁菌免疫机制方面的研究提供了工具。

分类号： Q78%S852.4

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