同步检测海水养殖动物5种病原菌的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立与应用

文献类型： 中文期刊

第一作者： 耿伟光

作者： 耿伟光;史成银;李晋;黄健;王秀华;谢国驷

作者机构：

关键词： 鳗弧菌;哈维氏弧菌;嗜水气单胞菌;迟缓爱德华氏菌;副溶血弧菌;套式PCR;检测

期刊名称： 农业生物技术学报

ISSN： 1674-7968

年卷期： 2013 年 21 卷 09 期

页码： 1125-1134

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)是我国海水养殖动物5种重要的病原菌。本研究在分析了其致病因子基因的基础上,依据扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)的原理,设计了5套特异性的套式PCR引物,并在各内引物的5'端分别加上能被一对通用引物识别的标签序列;通过对套式PCR中影响扩增结果的引物混合物浓度、退火温度、Mg2+浓度、dNTPs浓度以及Taq DNA聚合酶浓度等5个反应参数的调整和优化,最终建立了一种能同步检测海水养殖动物5种常见病原菌的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR反应体系为:10×PCR Buffer 5μL(含20 mmol/L的Mg2+),dNTP(各2.5mmol/L)5μL,Taq酶(2.5 U/μL)0.6μL,10×Primer Mix(2μmol/L)5μL,DNA模板各1μL,灭菌双蒸馏水补足至50μL,反应的退火温度为55℃。实验结果表明:对鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和副溶血弧菌这5种病原菌,使用该方法可以在1支反应管内快速、同步进行检测,得到大小分别为144、190、266、315和371 bp的特异性产物,其检出灵敏度分别为1.745、1.847、16.000、28.126和369.900 pg细菌基因组DNA;该方法特异性强,与大肠杆菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等其他细菌以及半滑舌鳎基因组DNA不产生交叉反应。2012年,应用该Arm-PCR方法对分离自病鱼的24个优势菌株进行了检测,确定出5株迟缓爱德华氏菌、3株嗜水气单胞菌、2株哈维氏弧菌及2株副溶血弧菌,证实该方法具有良好的可靠性和实用性。该方法不仅适用于海水养殖动物中致病性鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌的快速、同步检测和病原流行情况调查,也为进一步开发相应的基因芯片检测方法打下了基础。

分类号： S941

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