香蕉果实MaNPC1基因原核表达及多克隆抗体制备

文献类型： 中文期刊

第一作者： 帅良

作者： 帅良;殷菲胧;廖玲燕;刘云芬;段振华;李丽;何雪梅;李昌宝;孙健

作者机构：

关键词： 香蕉;MaNPC1基因;原核表达;多克隆抗体;炭疽病;贮藏

期刊名称： 南方农业学报

ISSN：

年卷期： 2021 年 007 期

页码： 1753-1761

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】对香蕉果实非特异性磷脂酶C基因（MaNPC1）开放阅读框（ORF）进行原核表达,并制备其多克隆抗体,为深入探究MaNPC1在香蕉果实抵御炭疽病中的作用机制提供理论依据。【方法】克隆MaNPC1基因ORF序列,对其进行生物信息学分析及抗原性预测,并通过双酶切法构建其原核表达载体,利用热激法转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞中进行诱导表达,重组蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫新西兰兔,以制备多克隆抗体。同时,运用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测香蕉果实贮藏过程中在炭疽病侵染胁迫下MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量。【结果】重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1经双酶切后得到1650 bp的特异性条带,说明原核表达载体构建成功,将其转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞后成功表达。MaNPC1蛋白分子式为C2747 H4249 N769 O793 S10 ,分子量为61.06 k D,理论等电点（pI）为8.96;丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸含量较高,分别占氨基酸总数的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%;不稳定指数为47.14,表明其为不稳定蛋白;蛋白抗原区段丰富且亲水性氨基酸数目明显高于疏水性氨基酸,有利于后续抗体的制备。制备的多克隆抗体效价较高,为1∶2048000。Western blotting检测发现,香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平呈上升—下降—上升的变化趋势;炭疽病侵染组MaNPC1蛋白除贮藏15 d时的表达水平比对照组低外,其他贮藏时间均略高于对照组。实时荧光定量PCR检测结果表明,MaNPC1基因相对表达量在香蕉果实贮藏过程中呈逐渐上升趋势;贮藏315 d,炭疽病侵染组MaNPC1基因相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。【结论】炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平,故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。

分类号： S668.1

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