文献类型： 中文期刊

作者： 林田 ¹ ; 杨华 ¹ ; 李天菲 ¹ ; 刘灶长 ¹ ; 罗利军 ¹ ;

作者机构： 1.上海市农业生物基因中心

关键词： 种质资源;香石竹;茎尖;改良小液滴法;超低温保存

期刊名称： 农业科技与信息(现代园林)

ISSN： 1003-6997

年卷期： 2015 年 04 期

页码： 322-323

摘要： 香石竹(Dianthus caryophyfllus L.)为石竹科石竹属常绿亚灌木花卉,是世界著名的切花之一,其栽培种及野生种的资源有效保存对香石竹的国产化至关重要。超低温保存(-196℃)是无性繁殖的植物种质资源最安全经济的保存方法。超低温保存方法中常用的为玻璃化法,近年来在传统玻璃化法上发展出来小液滴法,即将植物材料经玻璃化处理后,在铝箔上滴成小液滴,后直接投入液氮进行迅速冷冻。由于冻存及解冻速度快,组织不易形成冰晶,易成活再生,是一有发展前景的方法。超低温保存中,茎尖大小及结构的完整性对超低温保存的成活率及恢复培养均有影响。我们以香石竹为模式植物,结合包埋法及小液滴法的特点,对相关技术进行改进,探索一种适用于植物茎尖超低温保存方法及冷冻植株后再生的技术。试材为香石竹红花品种,从上海花卉市场购买。切取花茎繁殖试管苗,获得花茎无性繁殖系。取组培继代3个月以上的无菌组培苗。茎尖超低温保存的试验方法为:1、常规玻璃化法:(1)剥取1~2mm无菌苗茎尖,接种到含0.3 mol·L-1蔗糖浓度的MS培养基中,在25℃下培养1~3d;(2)经预培养后,将茎尖置于含预处理液(含2 mol·L-1甘油及0.4 mol·L-1蔗糖的MS培养液)的2ml冷冻管中,于室温下处理60min,然后将预处理液吸出,换入预冷玻璃化保护剂PVS2中在冰浴中处理60~120min;(3)冷冻管换入预冷新鲜PVS2约0.5ml,迅速投入液氮中保存。解冻取出在液氮中冻存1 h以上的冷冻管,立即放入40℃水浴中快速解冻2 min。(4)茎尖在室温下用含1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液洗涤2~3次,每次5~10 min。(5)洗涤后的茎尖在滤纸上吸干后,转移至恢复培养基中暗培养,等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中常光培养。2、小液滴法:步骤(1)、(2)同常规玻璃化法;(3)在冻存前5min将含有1个茎尖的液滴(约5ul)滴在5mm×20mm的无菌铝箔条上,每个铝箔条含5个茎尖,将含液滴的铝箔条直接投入装满液氮的安培管中。(4)解冻时直接将含液滴的铝箔条投入洗涤液中进行解冻20 min。步骤(5)同上。3、改良小液滴法:(1)剥取1~2mm无菌苗茎尖,浸入2%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸,即用镊子将茎尖轻放在3mm×20mm无菌滤纸小条上,每个滤纸条上放5~10个茎尖;(2)将含有茎尖的滤纸小条浸入到0.1%氯化钙溶液中,经10min固定,在无菌滤纸上吸干多余液体;(3)将带有茎尖的滤纸小条放入0.3 mol·L-1蔗糖的MS液体或固体培养基中,培养1~3d;(4)经预培养后,将带有茎尖的滤纸小条置于预处理液(含2 mol·L-1甘油及0.4 mol·L-1蔗糖的MS培养液)中于室温下处理60min,然后转入玻璃化保护剂PVS2中在冰浴中处理60~120min;(5)将带有茎尖的滤纸小条直接投入液氮中,长期保存可转移至无菌冷冻管;(6)解冻时将带有茎尖的滤纸小条由管中拿出后迅速放入含1.2 mol·L-1蔗糖的MS培养液解冻及洗涤20min;(7)将带茎尖的滤纸条在无菌滤纸上吸干后放入恢复培养基进行培养,经恢复培养后茎尖可直接生长成植株。结果表明:3种玻璃化法冻存的香石竹茎尖成活率及再生率均可达80%。其中小液滴玻璃化法在优化程序下进行冻存,最高存活率可达95%,高于常规玻璃化法(82%)及改良小液滴玻璃化法(87%)。恢复培养时,最快1d即可见茎尖萌动,再生时间较常规玻璃化法要短3~5d,但再生率不稳定(60%~100%),易形成愈伤组织及玻璃化苗。改良小液滴法成活率(80%~90%)略高于常规玻璃化法,再生时间与常规玻璃化法相同(7~13d),植株再生率均在80%以上且植株生长健壮一致。改良小液滴法结合包埋法及小液滴法的特点,并采用滤纸小条为操作载体,以批量处理茎尖以提高操作效率,减少在操作过程中机械损伤,从而达到稳定的成活率及再生率,受操作者水平影响较小,可用于种质库批量化植物茎尖资源超低温保存。