文献类型： 中文期刊
作者： 王清未 1 ; 李振阳 1 ; 张效生 2 ; 张林林 1 ;
作者机构： 1.天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室
2.天津市农业科学院畜牧兽医研究所
关键词： 免疫缺陷动物;CRISPR/Cas9;猪;RAG1;sgRNA
期刊名称： 黑龙江畜牧兽医
ISSN： 1004-7034
年卷期： 2024 年 009 期
页码： 1-7,114-115
收录情况： 北大核心
摘要： 为了利用显微注射一步法构建RAG1基因敲除的免疫缺陷猪模型，试验利用CRISPR/Cas9技术针对猪的RAG1基因设计并筛选出高效的sgRNA，与体外转录的Cas9 mRNA按照4∶6比例混合后显微注射到猪体外受精的受精卵中，随后将基因编辑的受精卵移植到受体母猪输卵管内;仔猪出生后采集耳缘皮肤组织提取基因组进行PCR扩增、T7核酸内切酶Ⅰ酶切鉴定，以及利用Sanger法测序鉴定编辑后基因型;监测基因敲除的免疫缺陷仔猪在普通环境的生存周期;对死亡的仔猪进行剖检，采集胸腺和脾脏等免疫器官进行组织学分析。结果表明:通过在猪成纤维细胞系水平上进行RAG1基因敲除效率的筛选，筛选出针对猪RAG1基因第2外显子高效敲除的sgRNA序列，通过对猪受精卵胞质显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物，获得2头RAG1基因敲除免疫缺陷仔猪，经鉴定发现RAG1基因的第2外显子碱基序列中有1 bp插入，造成移码突变，破坏了RAG1基因功能，致使仔猪免疫系统缺陷。出生的2头免疫缺陷仔猪在普通饲养环境的存活时间分别为19 d和33 d。RAG1基因敲除的免疫缺陷仔猪胸腺缺失，脾脏发育不良，无法在正常饲养环境中长时间存活。脾脏结构紊乱，出现炎症细胞浸润等免疫系统异常。说明通过CRISPR/Cas9技术进行显微注射可获得RAG1基因敲除的免疫缺陷猪模型。
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