文献类型： 中文期刊

作者： 唐晟 ¹ ; 马瑶 ¹ ; 冯贺龙 ² ; 李丽 ² ; 汪宏才 ² ; 张蓉蓉 ² ; 曾哲 ² ; 姚伦 ² ; 温国元 ² ; 邵华斌 ² ; 罗青平 ² ; 曾驰 ¹ ; 谢佳燕 ¹ ; 商雨 ² ;

作者机构： 1.武汉轻工大学生命科学与技术学院

2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室&畜禽病原微生物学湖北重点实验室

关键词： 坦布苏病毒;E蛋白;原核表达;间接ELISA;抗体

期刊名称： 黑龙江畜牧兽医

ISSN： 1004-7034

年卷期： 2024 年 016 期

页码： 54-61,116

收录情况： 北大核心

摘要： 为了大量表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并建立一种可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，试验首先将去除跨膜域的截短坦布苏病毒E基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，用IPTG诱导表达重组蛋白，利用His标签对表达的重组蛋白进行纯化；然后以重组蛋白为包被抗原、鸭待测血清为一抗、HRP标记兔抗鸭IgG为二抗，通过反应条件[抗原包被质量浓度、抗原包被条件、封闭液、封闭时间、一抗(待测血清样品)稀释液、一抗(待测血清样品)稀释度、一抗(待测血清样品)孵育条件、二抗稀释度、二抗孵育条件和显色条件]的优化和临界值的确定建立间接ELISA方法；最后进行特异性、敏感性和重复性试验，并通过临床样品检测比较该方法与Western-blot方法的符合性。结果表明：PCR扩增得到大小为1 227 bp的坦布苏病毒截短E基因，经双酶切与测序验证后，成功构建重组表达质粒pET28a-E-tr。诱导后的重组蛋白分子量大小为49 ku并以包涵体的形式表达，纯化后的重组蛋白条带单一，可与鸭源坦布苏病毒阳性血清发生特异性结合。建立的ELISA方法优化后的抗原包被质量浓度为5μg/mL,抗原包被条件为4℃过夜，封闭液为2%BSA,封闭时间为60 min,一抗(待测血清样品)稀释液为1%BSA,一抗(待测血清样品)稀释度为1∶800,一抗(待测血清样品)孵育条件为37℃、30 min,二抗稀释度为1∶7 500,二抗孵育条件为37℃、90 min,显色条件为37℃、10 min,阴阳临界值为0.368;仅可检测出鸭源坦布苏病毒阳性血清，无法检测出鸭源鸭疫里默氏杆菌、新城疫病毒、禽腺病毒、禽流感病毒、细小病毒阳性血清；待测血清最高稀释度为1∶3 200(Western-blot方法待测血清最高稀释度仅为1∶1 600);批次内重复变异系数(CV)为1.7%～4.7%,批次间重复CV为1.4%～5.7%;对137份临床鸭血清样品进行检测，阳性率为81.7%,与Western-blot方法比较样品阳性率较高，两种方法的符合率为87.6%。说明成功表达了坦布苏病毒截短E蛋白，并建立了一种特异性良好、敏感性较高、重复性较好的可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。